אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים
Summary
אי-התאמות לויקוציטים אנושיים רצפים אנטיגן (הלע) בין תורם איברים זוגות הנמענים הם הגורם העיקרי של דחיות בתיווך נוגדנים השתלת איברים. כאן אנו מציגים את השימוש מערכים אנטיגן מותאמות אישית המבוססות על רצפים התורמים הבודדים הלע כדי לחקור התורם אנטי alloantibodies הלע ב עוגב נמענים.
Abstract
השתלת איברים, הפונקציה ואריכות ימיהם של השתל באורח קשה להסתמך על ההצלחה של שליטה דחייה אימונולוגי תגובתיות נגד אנטיגנים לויקוציטים אנושיים (הלע). הנחיות histocompatibility מבוססות על בדיקות מעבדה anti-הלע חסינות, המציג כמו קיימים גם או דה נובו שנוצר הלע נוגדנים המהווים מכשול השתלת הגדולות. בדיקות הנוכחי בנוי על פלטפורמה חרוזים יחיד-אנטיגן (SAB) באמצעות סט קבוע של אנטיגנים שנבחרו מראש ~ 100 הלע רקומביננטי כדי לחקור להשתלות סרה. עם זאת, אצל בני אדם קיימים מגוון גדול של סוגי הלע, עם אין שני אנשים שאינם תאומים זהים אשר יכולים לשתף אותו צירוף של רצפי הלע. ואילו טכנולוגיות מתקדמות הלע הקלדת ורצף ישירה בדיוק יכול ללכוד כל אי-התאמות ברצף ה-DNA בין תורם הלע של הנמען, וזמינותו SAB, בשל מגוון מוגבל בייצוג רצף, אין אפשרות לזהות במדויק alloantibodies ובמיוחד נגד התורם הלע התאמות. אנחנו ביקשו לפתח שיטה משלימים באמצעות טכנולוגיה שונים כדי לזהות ולאפיין התורם נגד נוגדנים הלע על בסיס אישי. הכלי ההקרנה הוא מערך פפטיד מותאם אישית של התורם נגזר הלע רצפי דורשים בדיקה שלאחר ההשתלה סרה של הנמען איברים כדי להעריך את הסיכון לדחייה בתיווך נוגדנים. על מערך יחיד עבור זוג התורם-נמען אחד, עד 600 פפטידים ייחודי מתקבלות של התורם הלע חלבון רצפים, כל פפטיד נושאת משקעים שאינם תואמים אחד לפחות ברצף חומצה אמינו 15. בניסויים הטייס שלנו כדי להשוות בין אנטיגן תבניות עבור קדם והשתלות שלאחר סרה על מערכים אלה, היינו מסוגלים לזהות אנטי-הלע אותות עם הרזולוציה המתאימה גם מאפשרת לנו לאתר את epitopes החיסון המעורבים. אלה אישית אנטיגן מערכים לאפשר זיהוי ברזולוציה גבוהה של epitopes הלע תורם ספציפי בהשתלת איברים.
Introduction
איברים טיפול זה מבוצע באופן שגרתי ברחבי העולם הציל חייהם של מיליוני אנשים. השתלת איברים מוצקים מתרחשת בחולים כ-100 לכל מיליון אנשים בארה ב מדי שנה, בעוד מספר גדול עדיין נמצאים על waitlists לקבל תורם איברים עקב מחסור חמור האספקה (על פי המידע הנמסר על ידי איבר המין השתלת רשת – OPTN/בוועדה ורכש: optn.transplant.hrsa.gov). איברים להשתלות הוא מאוד מווסתות על מנת לצמצם בזבוז איברים, להציל חיים, אבל בכלים מדעיים נהגו ליידע את התקנות האלה מוגבלים היעילות. למשל, הקהילה המדעית מזהה באופן מלא ארצות רב-צורתיות מאוד של מולקולות הלע, בדיקות גנטיות מדויק של ה-DNA באמצעות הקלדת ברזולוציה גבוהה המבוססת על רצף הקלדה (SBT) פותחו בשנים האחרונות1, 2. עם זאת, שיטות בדיקה alloantibody טרם מסוגל לייצר במגוון עצום של רצפים הלע נפרדים כמו אנטיגן הגששים. במבחן סטנדרטי כיום משתמשת לוח מחזוריים של אנטיגנים allelic ~ 100 זה המורכב מעובדים וריאציות נפוצות של הלע, A, B, C, DQ, DP וד ר רצף אוכלוסיות האדם3,4,5,6. לעתים קרובות, רצפים הלע של התורם בפועל אינם כלולים בלוח של הבדיקה, מכריח ההשתלות לרופאים ומנתחים להסיק תגובתיות תורם ספציפי המבוסס על קווי דמיון משותפים בין רצפים בפועל של התורם המתאים “תקני” מבחן להגדיר7,8. כתוצאה מכך, זה לפעמים מאתגר לבצע אומדן אמין של דחייה סיכון לפי נוגדנים בדיקת תוצאות9,10,11,12. לכן, חדש באופן אישי בדיקות הניתנות להתאמה אישית עבור alloantibodies הן בדחיפות13,14.
הגנים הלע לקודד histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) קולטנים יש פונקציה מפתח תגובות חיסוניות6. הלע גנים ידועים להיות הגנים רב-צורתיות ביותר של הגנום האנושי6. בשל התקדמות מהירה ב- DNA רצף אסטרטגיות על הגנים הלע, גרסאות חדשות allelic (או פשוט המכונה אללים) מתגלים בגיל קצב נפץ15,16. על ידי 2017/03, אללים המאומת 16,755 היה הופקדה למסד הנתונים של IMGT/הלע (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), של אילו 12,351 היו של הכיתה, 4,404 היו של class II קבוצות. בניגוד מוחלט, רק קצת יותר מ-100 אללים שונים מיוצגים וזמינותו אנטיגן יחיד רגיל חרוזים (SAB), אשר משמש באופן שגרתי כדי לזהות alloantibodies השתלת איברים. השיטה SAB בנוי על פלטפורמה Luminex באמצעות cytometry זרימה. מאז וזמינותו מנצל ערכה מחזוריים של אנטיגנים, מלבד קטין variabilities אצווה כדי אצווה בייצור, הבדיקה נסיוב החיסון יכול להיות robustly סטנדרטית על פני יחידים ועל -פני מעבדות5. עם זאת, במבחן זה אין אפשרות ללכוד כל alloantibodies שפותחה במיוחד כנגד אללים התורם, במיוחד כאשר רצפי התורם נעדרים מתוך SAB הגדר. ייצור מותאם אישית של אנטיגנים התורמים המבוססת על רצף נכון אמנם רצוי, נותרו אתגרים טכניים ייעול הייצור הדרושים ובדיקות הליכים.
אנחנו לאחרונה תיאר מתודולוגיה חלופי במחקר היתכנות של השתלת כליות נושאים17. השיטה להשתמש פפטיד אנטיגנים בתבנית המערך דורשים בדיקה מראש, שלאחר ההשתלה סרה של נושאים בודדים. כל המערך היה מותאם אישית נבנה באמצעות נקודה סינתזה שיטת18,19,20,21,22,23 שמייצר פפטיד אנטיגנים, כל 15 חומצות אמינו אורך, לחלוטין המבוסס על הלע אללים התורם איברים בהתאמה של A, B, C, DQA1, DQB1 ו DRB1. סינתזה ספוט מופעל על קרום תאית באמצעות Fmoc-כימיה תקן22 והוא יכול לייצר מאות פפטידים מותאם אישית במקביל מערכת רובוטית אוטומטית לחלוטין19,21. המערך קרום יכול לעמוד מספר סבבי בנוכחות אחר, reprobing מחזורי. מחקר רטרוספקטיבי שלנו17, הבחנו שינויים בדפוסי אנטיגן עם אנטיגן להשתלות מאוחסנות שנאספו בסדרה זמן (קרי, לפני ואחרי השתלת). במסמך זה אנו מתארים פרוטוקול טכני עבור זרימת העבודה כולל מערך עיצוב, ייצור, חיטוט בנסיוב וניתוח התוצאות. השיטה מיועדת לגילוי alloantibodies נגד epitopes ליניארית ספציפי על הלע מולקולות השתלת התורמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
העיצוב של המערך במקום המתואר כאן הוא במחקר ניסיוני היחודיות alloantibody ב השתלת נגד אנטיגנים הלע של תורם איברים. בניגוד וזמינותו SAB הקיימים בשימוש נרחב במרפאה, שיטת מערך אנטיגן יש יתרון גדול בעיצוב גמיש שיכול להכיל את רצפי הלע האמיתי של התורם בודדים. הפלטפורמה החדשה מנצלת את הפוטנציאל של הטכנו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד”ר שון Li, Li Xing של אוניברסיטת ווסטרן בקנדה לסיוע שלהם אדיב עם ספוט מערך הייצור. אנחנו אסירי תודה לחברי הצוות הליבה Histocompatibility ובבית את מקיף השתלת סנטר של אוניברסיטת נורת’ווסטרן למתן שירותים לדוגמה עבודה זו ייצורם נתמך בחלקה על ידי עזר הלוח של נורת’ווסטרן ממוריאל החולים, ועל ידי קרן הפעלה סגל המסופקים על ידי אוניברסיטת נורת’ווסטרן כדי ג’יי ג’יי.
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
References
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD–the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
- Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients – Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great?. Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
- Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
- Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
- Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
- Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
- Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation–Worth the Risk?. N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
- Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
- Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem?. Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
- Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about?. Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
- Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
- Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing – getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
- Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
- Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
- Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
- Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
- Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
- Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
- Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
- Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
- Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
- Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
- Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).
