Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

Traditioneel is immuniteit geboden door de seizoensgebonden griepvaccin beoordeeld door de hemagglutination inhibitie (HI) assay¹, die de aanwezigheid van antilichamen die gericht zijn op de receptor bindende site van het hemagglutinine meet. Deze antilichamen HI-actieve steriliserende immuniteit kunnen verlenen, maar zijn over het algemeen smal in hun breedte van bescherming, het verlenen van immuniteit aan slechts een select paar stammen van het influenzavirus. De isolatie en de karakterisering van de breed-reactieve monoclonal antilichamen die de hemagglutinine (HA herkent) stel voor dat de ontwikkeling van een universele griepvaccin ligt binnen handbereik^{2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8}. een van de belangrijkste doelen van een universele influenza vaccin is voor het opwekken van een sterke antistofrespons richting de geconserveerde gebieden van het influenza virus^{9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16}. in het algemeen reactief antilichamen die deze geconserveerde epitopes, samengesteld uit zowel neutraliseren en niet-neutraliserende antilichamen^{17,18 herkent}, is aangetoond dat ze vereisen Fc-FcγR interacties voor optimale bescherming in vivo en markeer de bijdrage van Fc-gemedieerde immuniteit aan de algehele immune reactie op griep virus^19,20.

Correlaten van bescherming zijn van cruciaal belang bij de beoordeling van immuniteit tegen infectie. Deze statistieken kunnen wetenschappers en clinici te schatten van de werkzaamheid van vaccins, de betekenis van de gegevens, en de cursus van behandeling. Het enige gevestigde correlaat van bescherming tegen besmetting van de griep-virus is de hemagglutination inhibitie-test. Een titer van 1:40 is geassocieerd met een vermindering van 50% in het risico van ziekte^1,21 – en weerspiegelt de aanwezigheid van antilichamen die een remmende werking van agglutinatie richten op de receptor binden vindplaats op de bolvormige kop van de HA. Echter moet ook opgemerkt worden dat T-cel reacties een betere correlaat van bescherming tegen besmetting van het virus van de griep op de ouderen wellicht. Interessant, suggereert een recent rapport dat neuraminidase remming activiteit kan een betere voorspeller van immuniteit tegen influenza²². Gelukkig, typisch in vitro testen zoals neutralisatie of neuraminidase remming assays HA stengel – of neuraminidase-specifieke antilichamen kunnen meten. De meeste van deze conventionele in vitro tests, echter alleen rekening houden met de functie van de antigeen-bindende regio van het antilichaam en meten niet de rol van de Fc-regio. Daarnaast zijn de bijdrage van niet-neutraliserende antilichamen die via Fc receptor betrokkenheid in vivo beschermen niet gevonden^17,18. Om te meten bescherming door antistoffen die Fc-gemedieerde immuniteit zoals antilichaam afhankelijk cel-gemedieerde cytotoxiciteit (ADCC induceren), is een robuust in vitro -assay nodig.

De onderstaande methode beoordeelt de mogelijkheid van lymfkliertest monoclonal antilichamen voor het opwekken van Fc-gemedieerde functies met behulp van een genetisch gemodificeerde Jurkat cellijn uiting geven aan een activeren RattenUitrustingen Typ 1 FcR, FcγRIV. De betrokkenheid van het antilichaam van de FcγR transduces intracellulaire signalering die triggers nucleaire factor van geactiveerde T-cellen-gemedieerde luciferase activiteit. De bepaling heeft diverse voordelen ten opzichte van traditionele technieken waarvoor isolatie en cultuur van primaire effector cellen en het gebruik van stroom cytometry gedetecteerd activering van Fc-gemedieerde effector functies^{19,23,24 ,25,26}. Ten eerste kan het protocol beschreven hier gemakkelijk worden aangepast aan het nemen verschillende virale doelen, FcγRs en antilichamen van verschillende soorten (METMENSELIJKE en lymfkliertest). Ten tweede, het gebruik van een gemodificeerde cel Jurkat lijn uiting geven aan een FcγR met een luciferase verslaggever gen onder een nucleaire factor van geactiveerde T-cel (NFAT) voorziet in een groot formaat assay die gemakkelijk kan worden geanalyseerd met behulp van een afleesapparaat meten van luminescentie. Hier wordt de traditionele activering van primaire effector cellen vervangen door de inductie van NFAT-luciferase op antilichaam betrokkenheid van een FcγR op het oppervlak van de Jurkat-cel. Deze bepaling van de indeling 96-wells-plaat zorgt voor de meting van maximaal vier verschillende monsters in triplicates met zeven verdunningen – een aantal monsters dat kan erg onhandig zijn om met behulp van traditionele technieken. Er zijn extra punten te overwegen met deze test die kan invloed hebben op het ontwerp van experimenten en de interpretatie van de gegevens. De virale doelstelling moet worden uitgedrukt op het celoppervlak om erkenning van het antilichaam. Om te verhelpen dit, kan het doel antigeen (bijvoorbeeld een interne virale eiwitten) direct worden bekleed op het oppervlak van een plaat. Echter is dit nog niet grondig getest. Bovendien, de gemodificeerde cellijn van Jurkat spreekt slechts één type FcγR activeren en doet niet express eventuele remmende FcγRs, terwijl de primaire cellijnen express alle receptoren in een fysiologische context.

We hebben eerder deze test gebruikt om aan te tonen dat epitoop specificiteit in een polyclonal context een cruciale rol speelt bij het reguleren van de Fc-gemedieerde effector functies en dat optimale activatie van antilichaam afhankelijk cel-gemedieerde reactie twee punten van vereist Neem contact op met^27,28. Hier beschrijven we een methode die het vermogen van de stengel-specifieke monoclonale antistoffen aan te gaan en het activeren van de RattenUitrustingen activeren FcγRIV beoordeelt. Hoewel er uitzonderingen^29,30, een groot aantal grotendeels reactief antilichamen richten op de regio antigenisch geconserveerde stengel van het hemagglutinine en zo een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van een universele influenza vaccin.