يصف لنا طريقة لقياس تنشيط وظائف المستجيب بوساطة لجنة التيسير بالأجسام المضادة التي تستهدف هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا. يمكن تكييفها مع هذا التحليل أيضا لتقييم القدرة [مونوكلونل] أو [بولكلونل] سيرا استهداف glycoproteins السطحية الفيروسية الأخرى للحث على الحصانة بوساطة لجنة التيسير.
الأجسام المضادة تلعب دوراً حاسما في اقتران الاستجابات المناعية الفطرية والتكيف ضد مسببات الأمراض الفيروسية من خلال مستضد ملزمة مجالات ومناطق Fc. هنا، ونحن تصف كيفية قياس التنشيط من نادي اكتب وظائف المستجيب بالأجسام المضادة استهداف هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا باستخدام خط الخلية جوركات المهندسة وراثيا معربا عن تفعيل لجنة التيسير 1-FcγR-باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تحديد مساهمة تفاعلات Fc FcγR محددة يمنحها المناعية باستخدام فحص في المختبر .
وقسمت تقليديا الحصانة التي يوفرها لقاح الإنفلونزا الموسمية من hemagglutination تثبيط (مرحبا) المقايسة1، الذي يقيس وجود الأجسام المضادة التي تستهدف موقع مستقبلات ملزم هيماغلوتينين. هذه الأجسام المضادة النشطة مرحبا يمكن أن يضفي حصانة تعقيم، ولكن عموما ضيقة في اتساع تلك الحماية، وتوفير الحصانة لفقط تحديد سلالات قليلة من فيروس الإنفلونزا. عزل ووصف رد الفعل على نطاق واسع [مونوكلونل تعترف هيماغلوتينين (ها) تشير إلى تطوير لقاح الإنفلونزا العالمي هو في متناول اليد، 2،،من34 5 , 6 , 7 , 8-أحد الأهداف الرئيسية من لقاح الإنفلونزا العالمي للحث على استجابة جسم قوي نحو المناطق المصانة من الإنفلونزا فيروس9،10،،من1112 , 13 , 14 , 15 , 16-على نطاق واسع ورد الفعل من الأجسام المضادة التي تعترف هذه يحافظ [ابيتوبس]، تتألف من إبطال وعدم تحييد الأجسام المضادة17،18، تبين أن تتطلب تفاعل Fc-FcγR للأمثل الحماية في فيفو وتسليط الضوء على مساهمة لجنة التيسير بوساطة الحصانة للاستجابة المناعية الإجمالية لفيروس الإنفلونزا19،20.
يرتبط الحماية تشكل عاملاً حاسما في تقييم مناعة ضد العدوى. هذه المقاييس تسمح للعلماء والأطباء لتقدير فعالية اللقاحات، وأهمية البيانات، وأثناء العلاج. ربط المنشأة الوحيدة للحماية ضد عدوى فيروس الإنفلونزا هو مقايسة تثبيط هيماجلوتيناتيون. يرتبط بتخفيض 50% في خطر المرض1،21 -عيار من 01:40 ويعكس وجود الأجسام المضادة التي تمنع تراص باستهداف مستقبلات ملزم موقع يقع على رأس كروي ها. ومع ذلك، تجدر الإشارة أيضا إلى أن الاستجابات تي خلية ربط أفضل من الحماية ضد عدوى فيروس الإنفلونزا لدى كبار السن. من المثير للاهتمام، تقرير صدر مؤخرا يشير إلى أن النشاط تثبيط النورامينيداز قد تكون مؤشرا أفضل من الحصانة للأنفلونزا22. لحسن الحظ، نموذجية في المختبر فحوصات مثل فحوصات تثبيط تحييد أو النورامينيداز يمكن قياس الأجسام المضادة المحددة ساق أو النورامينيداز هكتار. معظم هذه الاختبارات التقليدية في المختبر ، ومع ذلك، فقط تأخذ في الاعتبار الدالة لمنطقة مستضد ملزمة الجسم ولا تقيس دور منطقة Fc. بالإضافة إلى ذلك، المساهمة غير تحييد الأجسام المضادة التي تحمي عن طريق نادي مستقبلات المشاركة في فيفو لا الكشف عن17،18. من أجل قياس الحماية من الأجسام المضادة التي تحفز الحصانة Fc بوساطة مثل جسم الخلية التابعة بوساطة سيتوتوكسيسيتي (ADCC)، يلزم مقايسة قوية في المختبر .
الطريقة الموضحة أدناه ويقيم قدرة الأجسام المضادة مورين للحث على مهام لجنة التيسير بوساطة من خلال استخدام خط خلية جوركات معدلة وراثيا معربا عن تفعيل الفاري اكتب 1 FcR، FcγRIV. مشاركة FcγR جسم ترانسدوسيس داخل الخلايا مما يشير إلى أن العامل النووي مشغلات لوسيفراس تنشيط خلايا T-وساطة النشاط. التحليل مزايا عديدة على التقنيات التقليدية التي تتطلب العزلة والثقافة من خلايا المستجيب الأساسي واستخدام التدفق الخلوي للكشف عن التنشيط للمستجيب بوساطة Fc مهام19،23،24 ،،من2526. أولاً، بسهولة يمكن تكييفها لإدماج أهداف الفيروسية المختلفة، FcγRs، والأجسام المضادة من مختلف الأنواع (البشرية ومورين) البروتوكول هو موضح هنا. ثانيا، استخدام خلية جوركات تعديل خط معربا عن FcγR مع جين مراسل لوسيفراس تحت عاملاً نووية لتنشيط خلايا تي (نفات) يسمح شكل كبير مقايسة التي يمكن تحليلها بسهولة باستخدام قارئ لوحة قياس التﻷلؤ. هنا، يتم استبدال تنشيط خلايا المستجيب الأولية التقليدية مع إدخال نفات-لوسيفراس على جسم الاستعانة FcγR على سطح الخلية جوركات. يسمح هذا الفحص تنسيق لوحة 96-جيدا لقياس عينات مختلفة تصل إلى أربعة في تريبليكاتيس مع سبعة تخفيف – عدد من العينات التي يمكن أن تكون مرهقة باستخدام التقنيات التقليدية. وهناك نقاط إضافية للنظر مع هذا التحليل التي قد تؤثر على تصميم تجارب وتفسير البيانات. يجب التعبير عن الهدف الفيروسية على سطح الخلية من أجل الاعتراف بالضد. للتخفيف من هذا، قد المغلفة مستضد المستهدفة (مثل البروتينات فيروسية داخلية) مباشرة على سطح لوحة. ومع ذلك، هذا لم بعد يتم دقة اختبار. بالإضافة إلى ذلك، تعديل خط الخلية جوركات تعرب عن نوع واحد فقط من تفعيل FcγR ولا تعبر عن أي FcγRs المثبطة، بينما خطوط الخلايا الابتدائية التعبير عن جميع المستقبلات في سياق فسيولوجية.
وقد استخدمنا سابقا هذا الفحص لإثبات أن خصوصية حانمه في سياق [بولكلونل] يلعب دوراً حاسما في تنظيم وظائف المستجيب بوساطة لجنة التيسير وأن التفعيل الأمثل للاستجابة تعتمد على جسم الخلية بوساطة يتطلب نقطتين من اتصل27،28. وهنا يصف لنا أسلوب الذي يقيم قدرة خاصة بساق الأجسام المضادة لإشراك وتفعيل الفاري تفعيل FcγRIV. على الرغم من أن هناك استثناءات29،30، عدد كبير من الأجسام المضادة لرد الفعل على نطاق واسع تستهدف منطقة ساق antigenically يحافظ هيماغلوتينين، وهكذا تلعب دوراً مهما في تنمية الإنفلونزا العالمي لقاح.
الأسلوب الموصوفة هنا يسمح للمستخدم لقياس قدرة جسم [مونوكلونل] هكتار على حدة للمشاركة FcγRIV موريني. هو أعرب عن مستضد المستهدفة، هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا، على سطح الخلايا بعد الإصابة بالفيروس أو تعداء بلازميد الحمض النووي. المقايسة زيادة قابلة لاستخدام البروتينات الفيروسية المختلفة أ…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا المشروع في الجزء مع الأموال الفيدرالية من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية، والمعاهد الوطنية للصحة، وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، تحت سيرس العقد P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |