インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法
Summary
インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンを対象とする抗体による Fc を介したエフェクターの機能の活性化を測定する手法を提案します。この試金は、Fc 免疫を誘導するモノクローナル抗体やポリクローナル血清の他のウイルスの表面糖蛋白質をターゲットの能力を評価するために合わせることができます。
Abstract
抗体は結合の抗原結合ドメインと Fc 領域を介してウイルスの病原体に対する自然免疫と適応免疫応答に重要な役割を再生します。ここでは、活性化を測定する方法について述べる Fc のモノクローナル抗体、活性化を表現する遺伝子組み換え Jurkat 細胞株を用いるインフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンをターゲットによるエフェクター機能入力 1 Fc-FcγR このメソッドを使用して、。免疫グロブリンによって与えられた特定の Fc FcγR 相互作用の寄与は、生体外の試金を使用して決定できます。
Introduction
季節性インフルエンザ ワクチンによる免疫が伝統的赤血球凝集抑制 (HI) 試験1ヘマグルチニンの受容体結合部位を対象とする抗体の存在を測定するによって評価されました。これらアクティブ HI 抗体殺菌免疫を与えることができるが、一般に選択数株のインフルエンザ ウイルスのみに耐性を提供する保護の彼らの幅狭い。分離とヘマグルチニン (HA) を認識するモノクローナル抗体が広く反応の万能インフルエンザ ワクチンの開発に、届く2,3,4,を提案します。5,6,7,8. インフルエンザ ウイルス9,10、11,12の保存領域に向かって強い抗体応答を誘導する万能インフルエンザ ワクチンの主要な目的の 1 つです,13,14,15,16. 広く中和と非中和抗体17,18, から成り、これらの保存されたエピトープを認識反応性抗体が Fc FcγR 相互作用を要求する示されている最適な生体内で保護しインフルエンザ ウイルス19,20全体的な免疫応答に Fc 免疫の貢献をハイライトします。
保護の相関は感染への耐性を評価する上で重要であります。これらのメトリックは、ワクチンの有効性、データの意義と治療の過程を推定するためには、科学者や臨床医に許可します。インフルエンザ ウイルス感染症に対する保護の唯一の確立された相関は赤血球凝集抑制法です。1:40 の力価は病気1,21 -のリスクが 50% 削減に関連付けられて、結合部位 HA の球状の頭の上にある受容体をターゲットによって凝集を阻害する抗体の存在を反映します。しかし、T 細胞応答を高齢者におけるインフルエンザ ウイルス感染に対する保護のより良く関連付けることに注意もする必要があります。興味深いことに、最近の報告書では、ノイラミニダーゼ阻害作用をインフルエンザ22への耐性をより良く予測される示唆しています。幸いにも、一般的な体外中和やノイラミニダーゼ阻害アッセイは、HA 茎やノイラミニダーゼ特異的抗体を測定できるよう試金します。しかし、これら従来の in vitroアッセイのほとんどは、のみ、抗体の抗原結合の領域の機能を考慮、Fc 領域の役割を測定しません。さらに、Fc 受容体の関与体内を介して保護非中和抗体の貢献は検出された17,18ではありません。抗体依存細胞性細胞傷害 (ADCC) など Fc 免疫を誘導する抗体によって与えられる保護を測定するために堅牢なの in vitroアッセイが必要です。
下記の方法は、活性化を表現する遺伝子組み換え Jurkat 細胞ラインを使用して Fc 仲介機能を誘発するモノクローナル抗体の作製の能力を評価するマウス入力 1 FcR、FcγRIV。FcγR の抗体の関与は、細胞内シグナル伝達活性化 T 細胞を介したルシフェラーゼ活性のあるそのトリガーの核因子ペリプラズムします。アッセイ分離と主なエフェクター細胞の培養と Fc を介したエフェクター機能19,23,24 の活性化を検出するためのフローサイトメトリーの使用を必要とする従来の技法上のいくつかの利点があります。 ,25,26。最初に、ここで説明されているプロトコルは簡単にウイルスの異なるターゲット、FcγRs、および異なる種 (人間およびマウス) から抗体を組み込むに適応できます。第二に、変更された Jurkat 細胞の使用ラインによる発光測定プレート リーダーを使用して容易に分析することができます大規模な形式の試金のため核因子活性化 T 細胞 (NFAT) の下で、ルシフェラーゼ遺伝子を持つ FcγR により表現します。ここでは、主なエフェクター細胞の伝統的な活性化は、Jurkat 細胞の表面に FcγR の抗体婚約時 NFAT ルシフェラーゼの誘導に置き換えられます。この 96 ウェル プレート形式の試金 7 希釈-伝統的な技術を使用して面倒なことができるサンプル数でトリプリケートで最大 4 つの異なる試料の測定が可能です。実験の設計、データの解釈に影響を与える可能性がありますこのアッセイで考慮する点があります。ウイルスのターゲットは、抗体の認識のための順序で細胞表層に発現する必要があります。これを緩和するには、ターゲット抗原 (例えば内部のウイルス蛋白質) は、プレートの表面に直接コーティングがあります。しかし、これはまだテストされていません厳密。また、変更された Jurkat 細胞株 FcγR を活性化の 1 種類のみを表現、主細胞生理学的なコンテキストですべての受容体に表現の抑制の FcγRs を表現していません。
我々 は以前ポリクローナル コンテキストのエピトープ特異性が Fc を介したエフェクターの機能の調節に重要な役割を果たしていること、抗体依存性細胞媒介性応答の最適な活性化がの 2 つの点を必要とすることを示すためこの試金を使用しています。27,28にお問い合わせください。ここでは、従事し FcγRIV をアクティブにするマウスを有効に茎特異的モノクローナル抗体の能力を評価する手法について述べる。例外29,30が広く反応性抗体の数が多いヘマグルチニンの抗原に保存された茎地域をターゲットし、従って普遍的なインフルエンザの発展に重要な役割を果たすワクチン。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明した方法では、マウス FcγRIV を従事する特定の HA 抗体の能力を測定することができます。ターゲット抗原、インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンは、細胞の表面に感染後ウイルスやプラスミド DNA トランスフェクションによって表されます。試金はさらに他の FcγRs (人間またはマウス) との組み合わせで異なる表面表現のウイルス蛋白質を使用してに従うです。さらに、我々 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、一部国立研究所のアレルギーと感染症から連邦政府の資金で賄われている、健康の国民の協会の保健社会福祉省、CEIRS の下で契約 P01AI097092 04S1 (P.E.L.)。
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
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