JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

Abstract

נזק לדנ א מעוררת תגובות ספציפיות איתות ותיקון בתא, אשר חיוני להגנה של הגנום שלמות. לייזר microirradiation הפך כלי ניסויי חשוב לחקור את ה-DNA נזק התגובה (DDR) ויוו. היא מאפשרת ניתוח מתא בודד ברזולוציה גבוהה בזמן אמת של דינמיקה macromolecular בתגובה לייזר המושרה נזק מוגבל לאזור submicrometer בתוך גרעין התא. עם זאת, התנאים לייזר השונים שימשו ללא הערכה של הבדלים בין סוגי הנזק הנגרם. כתוצאה מכך, מהות הנזק הוא לעתים קרובות לא טוב מאופיין או נשלט, גורם חוסר עקביות לכאורה פרופילי גיוס או שינוי. להדגים כי תנאי הקרנה שונות (קרי, אורכי גל שונים וכן סמכויות קלט שונות (irradiances) של לייזר הפמטו-שנייה (fs)-סגול (ניר)) המושרה הרכבות חלבון ברורים של DDR ותיקון. זה משקף את סוג נזק לדנ א המיוצר. פרוטוקול זה מתאר איך טיטור של עוצמת הקלט הלייזר מאפשר אינדוקציה של כמויות שונות המורכבות של נזק לדנ א, אשר ניתן לנטר בקלות על ידי זיהוי של נזקים crosslinking, בסיס, פוליפוני דיפרנציאלית (ADP-ריבוז) (PAR) איתות, ו תיקון מסלול ספציפי הרכבות גורם נזק אתרים. ברגע נקבעים התנאים נזק, זה אפשרי לחקור את ההשפעות של נזק שונות המורכבות והאיתות נזק דיפרנציאלית, כמו גם דלדול של factor(s) נגד הזרם על כל גורם בעל עניין.

Introduction

אין ויוו ה-DNA נזק איתות זה אינם מובנים היטב
In vivo, ה-DNA הוא ומורכבת עם שינויים היסטוניים וגורמים אחרים כדי טופס כרומטין סיבים. ויסות הכרומטין היא בעלת חשיבות עליונה עבור ה-DNA חילוף החומרים. לדוגמה, הגרסה היסטון H2AX phosphorylated אטקסיה-telangiectasia מוטציה (ATM), אחרים kinases כפול הבאים-strand שובר אינדוקציה (DSB), ועל חשוב DSB נזק אות הגברה, כמו גם מתן אתר עגינה עבור השני גורמים. הפצת הבחירה מסלול איתות ותיקון הנזק מופיעים אנושות להיות מושפע הכרומטין מקומיים-נזק לאתרים1. מספר של כרומטין שיפוץ גורמים מלווים היסטון, היסטון שינוי אנזימים אכן גייסו לפגוע באתרים חשובים עבור תיקון דנ א יעיל, הדגשת החשיבות של כרומטין רגולציה ב- DDR ואת תיקון2 , 3 , 4. יתר על כן, נזק באתר קיבוץ באשכולות או שינוי מיקום נצפתה ב שמרים ו דרוזופילה5,6,7,8, מזכיר relocalization של ג’ין לוקוסים, תא subnuclear הקשורים עם ג’ין בתקנה9,10. מחקרים שנעשו לאחרונה העכבר, תאים אנושיים התגלה גם גיוס של אתרים DSB, אילו השפעות תיקון נאמנות ועל מסלול הבחירה11,12. זה מעלה את האפשרות כי DDR/תיקון גם בצורה אינטימית קשורה אדריכלות גרעיני כרומטין מיומנויות ארגון, כרומוזום דינאמיקה של גרעין התא. לפיכך, חיוני לפתח שיטות ברזולוציה גבוהה ללמוד DDR ולתקן תהליכים בהקשר של הסביבה גרעיני אנדוגני בתא חי כדי להבין קצר – ארוכת ההשלכות של נזק לדנ א.

תפקיד מכריע של PAR פולימראז (PARP) מודד במידה ואת סוג הנזק, ויסות חלבון הרכבה באתר נזק
PARP1 הוא חיישן ניק DNA מופעל במהירות על ידי נזק לדנ א שמשחקת תפקיד קריטי תיקון דנ א13. PARP1 חשבו תחילה לפעול יחד עם הרנטגן לתקן לחצות משלימים 1 (XRCC1) כדי להקל על כריתה הבסיס לתיקון (בער), אך מחקרים אחרונים לחשוף את תפקידה השני שמסלולי התיקון ה-DNA, כולל DSB תיקון14. PARP1 שימושים nicotinamide אדנין dinucleotide (NAD+) כמו מצע ל ADP-ribosylate מספר היעד החלבונים מופעל, כולל את עצמו. אנזים זה ובני משפחה אחרים משכו תשומת לב רבה בשנים האחרונות כפי מעכבי PARP הופיעו גם מבטיח תרופות טיפוליות עבור סרטן. למרות מעכבי PARP בתחילה נמצאו יעילים גנטי לסרטן השד (BRCA)-מוטציה תאים סרטניים בשד, עכשיו יש שפע של עדויות על ההשפעות שלהם במונו – שילוב טיפולים אלטרנטיביים יחד עם ה-DNA נזק סוכנים/הקרנה נגד קשת רחבה של סרטן עם מוטציות לא מוגבל ל- BRCA15,16,17,18,19,20.

ברמה המולקולרית, הפעלת PARP הוצגה לשחק תפקידים חיוניים בארגון הכרומטין מקומיים באתרים נזק. תלויי-PAR גיוס של כרומטין השינוי אנזימים מקלה DSB תיקון ותיקון מכתיבה בחירות מסלול, מציעה את תפקיד חשוב פיגומים PAR השינוי באתרים נזק. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 לאחרונה להדגים את החרגת מחייב p53 חלבון 1 (53BP1) מפני נזק אתרים על ידי PAR 32, מתן הסבר חלופי עבור תלויי-53BP1 hyperactivation של endjoining שאינם הומולוגיים ( NHEJ) על ידי PARP מעכב, המדגיש את חשיבות PARP ב DSB תיקון מסלול הבחירה33,34. PARP1 גם ישירות PARylates, משפיע על הפעילות של DNA מרובים תיקון גורמים14.

באמצעות לייזר Microirradiation ככלי לימודים DDR/תיקון In Vivo
לייזר microirradiation לייצר שינויים תת מיקרון על כרומוזומים בודדים היה תחילה תיאר בשנת 196935 , שנסקרו בפירוט 198136. כמה עשורים מאוחר יותר, לייזר microirradiation הוצגה כדי לגרום נזק לדנ א-אזור מוגדר submicrometer בתוך גרעין התא, ולא הוכח טכניקה יקר ללמוד גיוס או שינויים של גורמים שונים DNA נגעים vivo בתוך 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. שיטה זו מאפשרת זיהוי של גורמים אלו שיוצרות לא ברורים הקרנה-induced מוקדים (IRIF)-נזק לאתרים39,42. . זה גם ניתן לבחון את הדינמיקה ייתכן של שינויים מבניים כרומטין באתרים נזק והן בשאר חלקי הגרעין. השווינו בקפידה את DDRs המושרה על ידי מערכות לייזר שונים קלט כוחות כדי להעריך את הקשר בין סוג נזק לדנ א microirradiation תנאים32,43,44, 45. דפוסי גיוס aberrant של 53BP1 ושל telomeric חוזר מחייב פקטור 2 (TRF2) נצפו במחקרים קודמים לייזר נזק, אשר סיפקה את הבסיס על הדאגה מחזוריות הטבע “הלא-פיזיולוגיים” לנזק לייזר המושרה46 ,47,48,49. מצאנו כי אלו סתירות לכאורה יכול עכשיו להיות מוסברת על ידי PARP דיפרנציאלית איתות אשר בוחן את הכמות ואת המורכבות של נזק מושרה32. אנחנו אישר כי: 1) לייזר-microirradiated תאים (אפילו לאחר הקרנה גבוהה קלט-power) הם נעצרו ב לאטמוספרה באופן תלוי-בקרת מחסום נזק, מורדם (לפחות עד 48 שעות)32,50; ו- 2) תיקון גורם גיוס/שינויים בנאמנות מסכם את הדברים אלו נצפו עם טיפול קונבנציונאלי DNA סוכנים מזיק, אינדוקציה DSB endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. תוצאות אלה תומכים מאוד את הרלוונטיות פיזיולוגיים של הלומדים לייזר המושרה נזק הסלולר תגובות.

Protocol

1. התא הבסיסי הכנה הערה: השלב זה לגילוי סטנדרטי immunofluorescence של חלבון אנדוגני גיוס או שינוי, לשימוש של קו תא stably ביטוי חלבון רקומביננטי מתויגות fluorescently. לדוגמה, בתאי אפיתל של הכליה כיס Potorustridactylus (PtK2) לבטא stably EGFP-53BP11220-1711 או TRF2-YFP שימשו קודמות שלנו לומדים (איור 1<…

Representative Results

באמצעות תאים PtK2 stably להביע את EGFP-53BP11220-1711 או TRF2-YFP, לייזר כוח קלט טיטור בוצע כדי לקבוע את המצב האופטימלי עבור שלהם גיוס (איור 1)32. באתרים נזק גבוה קלט-כוח לייזר, משמעותי התקבצות של שיקגו (crosslinking נזק שנוצר בדרך כלל על ידי אולטרה סגול (UV) נזק) כמו גם…

Discussion

יתרונות השימוש microirradiation לייזר למחקר DDR הם:

1. זה ריאלי לזירוז סוגים שונים, כמויות של ה-DNA נזק ממעברי סטרנד פשוטים מורכבים נזק לדנ א, כדי לזהות גורמים שונים לתיקון על ה-DNA נזק אתרים על-ידי התאמת הפרמטרים הקרנה לייזר. זה גם אפשרי לגרום נזק מספר פעמים, גרעין התא אותו, על מנת להעריך א?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ד ר אקירה Yasui ב אוניברסיטת Tohoku, יפן על פלסמיד ביטוי GFP-NTH1, ד ר ארוס Lazzerini Denchi המחקר סקריפס המכון, הויה שבקליפורניה עבור TRF2-YFP ו- EGFP-53BP11220-1711 ביטוי פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי חיל האוויר Office של המחקר המדעי (FA9550-04-1-0101), בקמן לייזר המכון inc. לקרן (M.W.B), את מלגת קרן פורד של האקדמיה הלאומית למדעים (ל B.A.S), ואת ה-NSF MCB-1615701 CRCC CRR-17-426665 (ל- Y ק.).

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread–chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R., Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed?. Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A., Piccart, M. An update on PARP inhibitors–moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Laser MicroirradiationDNA DamageDNA RepairDNA Repair FactorsCellular ResponseReal-time AnalysisSingle-cell AnalysisFluorescently-tagged Proteins53BP1NTH1Liposome-mediated Transfection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image