والهدف من هذا البروتوكول لوصف كيفية استخدام الليزر ميكرويرادييشن لحمل أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي، بما في ذلك فواصل حبلا بسيطة نسبيا والأضرار معقدة، لدراسة الحمض النووي الضرر إشارات وإصلاح عامل الجمعية في مواقع الضرر الحية .
أضرار الحمض النووي يستحث ردود الإشارات وإصلاح محددة في الخلية، هو أمر حاسم لحماية سلامة الجينوم. ميكرويرادييشن الليزر أصبح أداة تجريبية قيمة للتحقيق الحمض النووي الضرر (DDR) وردا في فيفو. ويتيح تحليل خلية واحدة عالية الدقة في الوقت الحقيقي لديناميات الجزيئات في استجابة للأضرار التي يسببها الليزر تنحصر في منطقة سوبميكروميتير في نواة الخلية. ومع ذلك، استخدمت شروط مختلفة بالليزر دون تقدير للاختلافات في أنواع الأضرار التي يسببها. نتيجة لذلك طبيعة الأضرار التي كثيرا ما لا تكون كذلك تتميز أو يسيطر عليها، يسبب التضارب الواضح في التوظيف أو تعديل التشكيلات الجانبية. أظهرنا أن تشعيع مختلف الظروف (أي، أطوال موجية مختلفة، فضلا عن مختلف القوى الإدخال (إيراديانسيس) ليزر femtosecond (خ) القريبة من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)) الناجم عن التجميعات البروتين التسريح وإعادة الإدماج وإصلاح متميزة. وهذا يعكس نوع تلف الحمض النووي المنتجة. هذا البروتوكول ويصف كيف يسمح المعايرة لليزر مدخلات الطاقة التعريفي لكميات مختلفة وتعقيدات الأضرار الحمض النووي، والتي يمكن رصدها بسهولة بالكشف عن الأضرار قاعدة وكروسلينكينج، بولي التفاضلية (ADP-ريبوز) (PAR) الإشارات، و الإصلاح الخاصة بمسار الجمعيات عاملاً في مواقع الضرر. حالما يتم تحديد شروط الضرر، فمن الممكن للتحقيق في آثار تعقيد أضرار مختلفة ويشير إلى الأضرار التفاضلية وكذلك نضوب المنبع factor(s) على أي عامل للفائدة.
في فيفو مما يشير إلى تلف الحمض النووي هي “ليست مفهومة جيدا”
في فيفو، الحمض الرصاصية مع هيستونيس وغيرها من العوامل إلى ألياف الكروماتين النموذج. تنظيم هيكل الكروماتين من الأهمية بالنسبة استقلاب الحمض النووي. على سبيل المثال، هو البديل هيستون H2AX فوسفوريلاتيد ترنح-توسع الشعريات تحور (ATM) والأخرى مؤنزم حبلا مزدوجة التالية فواصل التعريفي (جهاز تسوية المنازعات)، ومن المهم لتضخيم إشارة تلف جهاز تسوية المنازعات، فضلا عن توفير موقع إرساء للآخر العوامل. ينتشر من اختيار مسار الإشارات وإصلاح الأضرار تظهر خطيرة يمكن أن يتأثر بهيكل الكروماتين المحلية في مواقع الضرر1. عدد من الكروماتين إعادة عرض العوامل ومرافقين هيستون هستون تعديل الإنزيمات يعينون في الواقع إتلاف المواقع وهامة لكفاءة إصلاح الحمض النووي، تسليط الضوء على أهمية تنظيم الكروماتين في التسريح وإعادة الإدماج وإصلاح2 , 3 , 4-وعلاوة على ذلك، لوحظ الأضرار موقع تجميع أو إعادة تموضع في الخميرة و المورفولوجية5،6،،من78، تذكرنا ريلوكاليزاتيون الجيني المكاني في حجرة سوبنوكلير المرتبطة بالجينات البند9،10. أيضا كشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا في الماوس والخلايا البشرية تعبئة المواقع جهاز تسوية المنازعات، والتأثيرات التي إصلاح الإخلاص ومسار اختيار11،12. وهذا يثير احتمال أن التسريح وإعادة الإدماج/إصلاح قد أيضا يكون ارتباطاً وثيقا بالهندسة النووية، ومنظمة الكروماتين مرتبة أعلى، وكروموسوم الديناميات في نواة الخلية. وهكذا، أنها حاسمة لتطوير أساليب عالية الاستبانة دراسة التسريح وإعادة الإدماج، وإصلاح العمليات في سياق البيئة النووية الذاتية في خلية حية من أجل فهم الآثار القصيرة الأجل والطويلة الأجل لتلف الحمض النووي.
الدور الحاسم للإسمية بوليميراز (تسنى) في قياس مدى ونوع الضرر وتنظم الجمعية البروتين في موقع الضرر
PARP1 هو جهاز استشعار نك الحمض النووي سرعة تفعيلها بأضرار الحمض النووي التي تلعب دوراً حاسما في إصلاح الحمض النووي13. PARP1 كان يعتقد أصلاً أن تعمل جنبا إلى جنب مع الأشعة السينية إصلاح عبر تكملة 1 (XRCC1) لتسهيل إصلاح قاعدة الختان (البر)، ولكن الدراسات الحديثة تكشف عن دورها في سائر مسارات إصلاح الحمض النووي، بما في ذلك إصلاح جهاز تسوية المنازعات14. تنشيط PARP1 الاستخدامات نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD+) كركيزة لشرطة أبوظبي-ريبوسيلاتي البروتينات المستهدفة متعددة، بما في ذلك نفسها. هذا الإنزيم وأفراد الأسرة الآخرين اجتذبت قدرا كبيرا من الاهتمام في السنوات الأخيرة حيث ظهرت مثبطات نشطت واعدة العقاقير العلاجية لحالات السرطان. على الرغم من مثبطات نشطت عثر في بادئ الأمر أن تكون فعالة في مورثة سرطان الثدي (بركة)-تحور خلايا سرطان الثدي، وهناك الآن عدد كبير أدلة لما لها من الآثار في مونو-والجمع بين العلاجات جنبا إلى جنب مع الحمض النووي يضر وكلاء/تشعيع ضد طائفة واسعة من أنواع السرطان مع الطفرات التي لا تقتصر على بركا15،16،،من1718،،من1920.
على المستوى الجزيئي، أبدى التنشيط تسنى القيام بأدوار حاسمة في تنظيم هيكل الكروماتين المحلية في مواقع الضرر. التوظيف تعتمد على قدم المساواة للإنزيمات تعديل الكروماتين يسهل إصلاح جهاز تسوية المنازعات وإصلاح ما تمليه اختيارات المسار، مما يشير إلى دور هام السقالات التعديل الاسمية في مواقع الضرر. 13،21،،من2223،24،25،26،27،،من2829، 30،31 أثبتنا استبعاد البروتين p53-ملزمة 1 (53BP1) مؤخرا من أضرار المواقع الاسمية 32، تقديم أي تفسير بديل لتعتمد على 53BP1 هايبراكتيفيشن (اندجوينينج غير المتجانسة نهيج) التي نشطت المانع وتسليط الضوء على أهمية نشطت في جهاز تسوية المنازعات إصلاح مسار اختيار33،34. PARP1 أيضا مباشرة تصليح باريلاتيس ويؤثر على نشاط الحمض النووي متعددة العوامل14.
باستخدام ميكرويرادييشن الليزر كأداة لدراسة التسريح وإعادة الإدماج/إصلاح في فيفو
أولاً وصفت في عام 196935 ميكرويرادييشن الليزر لإنتاج التعديلات الفرعية ميكرون في الكروموسومات الفردية واستعرض بالتفصيل في 198136. منذ عدة عقود في وقت لاحق، ميكرويرادييشن الليزر كان سيظهر للحث على أضرار الحمض النووي في منطقة سوبميكروميتير محددة في نواة الخلية، وقد ثبت أن تقنية قيمة لدراسة التوظيف أو تعديلات للعوامل المختلفة للحمض النووي آفات فيفو 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41-هذا الأسلوب يتيح الكشف عن تلك العوامل التي لا تشكل البؤر التي يسببها الإشعاع متميزة (عريف) في تلف مواقع39،42. من الممكن أيضا لدراسة ديناميات التغيرات الهيكلية الكروماتين في مواقع الأضرار وفي بقية النواة الزمانية المكانية. نحن مقارنة بعناية DDRs الناجمة عن نظم الليزر المختلفة وإدخال القوى لتقييم العلاقة بين نوع الضرر الحمض النووي وميكرويرادييشن الظروف32،،من4344، 45. تكرار أنماط التوظيف المنحرف ل 53BP1 وتيلوميريك عامل ملزم 2 (TRF2) وقد لوحظت في الدراسات أضرار الليزر السابقة، التي وفرت الأساس لقلق متكرر على الطابع “غير الفسيولوجية” للأضرار التي يسببها الليزر46 47، ،،من4849. وجدنا أن هذه التناقضات الواضحة الآن يمكن أن تفسر التي نشطت التفاضلية الإشارات التي مقاييس كمية وتعقيد الأضرار العمدي32. أكدنا أن: 1) الخلايا الليزر-ميكرويرادياتيد (حتى بعد ارتفاع مدخلات الطاقة التشعيع) اعتقل في الطور البيني بطريقة تعتمد على مراقبة نقطة تفتيش أضرار والبقاء (على الأقل ما يصل إلى 48 س)50من32،؛ و 2) إصلاح عامل التوظيف/التعديلات إخلاص الخص تلك التي لوحظت مع المعاملة مع العوامل الضارة الحمض النووي التقليدية وتحريض جهاز تسوية المنازعات قبل39،اندونوكليسيس،من3242، 44،50،،من5152. بشدة دعم هذه النتائج أهمية فسيولوجية دراسة الاستجابات الخلوية الناجمة عن أضرار الليزر.
مزايا استخدام الليزر ميكرويرادييشن للتسريح وإعادة الإدماج للبحث:
1-من الممكن للحث على أنواع مختلفة وكميات من الحمض النووي الضرر من فواصل حبلا بسيط إلى مجمع الحمض النووي الضرر، والضرر إصلاح مختلف العوامل في الحمض النووي للكشف عن المواقع بضبط المعلمات إشعاع الليزر. من الممك?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر الدكتور أكيرا ين في جامعة توهوكو باليابان بلازميد تعبير بروتينات فلورية خضراء-NTH1، والدكتور دينتشي لازيريني إيروس في معهد أبحاث سكريبس، في لاجولا بكاليفورنيا يفب TRF2 واجفب-53BP11220-1711 التعبير والبلازميدات. هذا العمل كان يدعمها مكتب القوات الجوية للبحث العلمي (FA9550-04-1-0101) ومؤسسة وشركة معهد الليزر بيكمان (إلى M.W.B)، وزمالة مؤسسة فورد من الأكاديمية الوطنية للعلوم (B.A.S)، والمجلس جبهة الخلاص الوطني-1615701 والمؤسسة CRR-17-426665 (إلى “ك. ص”.).
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
Heating System | Ibidi | 10918 | |
Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
Thymidine | SIGMA | T9250 | |
serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
Excel | microsoft | spreadsheet program | |
Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |