Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

In Vivo DNA-Schäden-Signalisierung ist nicht gut verstanden
In Vivo, ist DNA komplexiert mit Histone und andere Faktoren in Form Chromatin Fasern. Regulierung der Chromatinstruktur ist von größter Bedeutung für die DNA-Stoffwechsel. Beispielsweise ist die Histon-Variante H2AX phosphoryliert durch Ataxie-Teleangiektasie mutiert (ATM) und anderen Kinasen folgende Doppel-Strang bricht (DSB) Induktion, und ist wichtig für DSB Schaden Signalverstärkung sowie eine Docking-Website für andere Faktoren. Verbreitung von Schäden Signal- und Reparatur Weg Wahl scheinen kritisch von lokalen Chromatinstruktur bei Schäden Seiten¹beeinflusst werden. Eine Reihe von Chromatin umgestalten Faktoren, Histon Chaperone und Histon ändern Enzyme sind in der Tat rekrutiert, um Websites zu beschädigen und sind wichtig für effiziente DNA-Reparatur, die Bedeutung der Chromatin-Verordnung in der DDR und Reparatur^{2 , 3 , 4}. Darüber hinaus Schäden Website clustering oder Neupositionierung wurde beobachtet in Hefe und Drosophila^5,6,7,8, erinnert an Relokalisierung der gen-Loci in der subnukleare Fach gen Verordnung^9,10zugeordnet. Neuere Studien in Maus und menschlichen Zellen gezeigt auch Mobilisierung der DSB-Seiten, welche Einflüsse Treue und Weg Wahl^11,12reparieren. Dies wirft die Möglichkeit, dass die DDR/Reparatur auch eng mit nuklearen Architektur, höherer Ordnung Chromatin Organisation und Chromosom Dynamik im Zellkern verbunden werden kann. Daher ist es wichtig, entwickeln hochauflösende Methoden, die DDR zu studieren und Reparaturprozesse in der endogenen nuklearen Umfeld in einer live Zelle um kurz- und langfristigen Folgen von DNA-Schäden zu verstehen.

Entscheidende Rolle der PAR Polymerase (PARP) bei der Messung das Ausmaß und die Art des Schadens und Regulierung Protein Montage am Standort Schaden
PARP1 ist ein DNA-Nick-Sensor schnell aktiviert durch DNA-Schäden, die in DNA Reparatur¹³eine entscheidende Rolle spielt. PARP1 wurde ursprünglich gedacht, um zusammen mit x-ray reparieren Cross Ergänzung 1 (XRCC1) base Excision Repair (BER) zu erleichtern, aber neuere Studien zeigen seine Rolle in anderen DNA-Reparatur Bahnen, darunter DSB-Reparatur-¹⁴. Aktiviert PARP1 Verwendungen Nicotinamid Adenin Dinucleotide (NAD⁺) als Substrat zu ADP-Ribosylate mehrere Zielproteine, einschließlich sich selbst. Dieses Enzym und andere Familienmitglieder haben viel Aufmerksamkeit in den letzten Jahren angezogen, wie PARP-Inhibitoren als viel versprechende Medikamente gegen Krebs entstanden sind. Obwohl PARP-Inhibitoren zunächst fand bei Brustkrebs-Gen (BRCA) wirksam-Brustkrebs-Zellen, mutiert es gibt jetzt eine Fülle von Beweisen für ihre Wirkungen in Mono- und Kombination Therapien zusammen mit DNA Beschädigung Agenten/Bestrahlung gegen ein breites Spektrum an Krebserkrankungen mit Mutationen nicht beschränkt auf BRCA^{15,16,17,18,19,20}.

Auf der molekularen Ebene zeigte PARP Aktivierung spielen wichtige Rollen bei der Organisation der lokalen Chromatinstruktur Standorten Schaden. PAR-abhängigen Rekrutierung von Chromatin Modifikation Enzyme erleichtert die DSB-Reparatur und Diktat reparieren Weg Möglichkeiten, was die wichtige Gerüst Rolle PAR Modifikation an Schaden Standorten. ¹³,^{21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31} , wir haben vor kurzem gezeigt, den Ausschluss von p53-bindendes Protein 1 (53BP1) vor Schäden durch PAR ³², bietet eine alternative Erklärung für 53BP1-abhängige Überaktivierung des nicht-homologe Endjoining (Seiten NHEJ) durch PARP-Inhibitor und Hervorhebung der Bedeutung von PARP in DSB reparieren Weg Wahl^33,34. PARP1 Faktoren direkt PARylates und wirkt sich auf die Aktivität von mehreren DNA Reparatur auch¹⁴.

Mit Laser Microirradiation als Werkzeug zur DDR/Reparatur In Vivo Studie
Laser Microirradiation, Sub-Mikrometer-Änderungen auf den einzelnen Chromosomen zu produzieren wurde zuerst 1969³⁵ beschrieben und detailliert in 1981³⁶geprüft. Einige Jahrzehnte später, Laser Microirradiation wurde gezeigt, dass DNA-Schäden an einer definierten Submikrometer-Region im Zellkern zu induzieren, und erwies sich als eine wertvolle Technik, Einstellung oder Modifikationen verschiedener Faktoren zu DNA-Läsionen in Vivo zu studieren ^{13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41}. diese Methode ermöglicht die Erkennung von jene Faktoren, die keine ausgeprägte Bestrahlung-induzierte Brennpunkte (IRIF) bilden, um Schäden Seiten^39,42. Es ist auch möglich, die räumlich-zeitliche Dynamik des Chromatin Strukturveränderungen an Schaden Standorten und in den Rest des Kerns zu untersuchen. Wir sorgfältig verglichen die DDRs induziert durch verschiedene Lasersysteme und Befugnisse, die Beziehung zwischen der Art von DNA-Schäden und die Microirradiation Bedingungen^{32,43,44, zu bewerten 45}. Die aberrante Einstellungsmuster der 53BP1 und telomeric wiederholen Bindungsfaktor 2 (TRF2) beobachtet in den vorherigen Laser Schaden Studien, die die Grundlage für die wiederkehrende Sorge um die “physiologisch” Art der Laser-induzierten Schäden^{46 ,47,48,49}. Wir fanden, dass jetzt diese wesentlichen Unterschiede erklärt werden könnte, durch differenzierte PARP Signalisierung, die Menge und Komplexität der induzierten Schäden³²Lehren. Wir bestätigen, dass: 1) Laser-Microirradiated Zellen (auch nach hoher Eingangsleistung Bestrahlung) sind in einer Beschädigung Prüfpunkt Kontrolle-abhängigen Weise in Interphase verhaftet und lebensfähig bleiben (mindestens bis zu 48 h)^32,50; und 2) Reparatur Faktor Rekrutierung/Modifikationen treu rekapitulieren die Behandlung mit herkömmlichen DNA-schädigenden Agenzien und DSB Induktion von Endonucleases^{32,39,42, beobachtet 44,50,51,52}. Diese Ergebnisse unterstützen nachdrücklich die physiologische Relevanz Laser Schaden-induzierte zelluläre Reaktionen zu studieren.