Einfache Beseitigung von Hintergrundfluoreszenz in Formalin fixiert menschliche Gehirngewebe für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Hintergrund Autofluoreszenz biologischer Proben erschwert oft Fluoreszenz basierende bildgebende Verfahren, vor allem im Alter menschlicher postmitotischen Gewebe. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Autofluoreszenz aus diesen Proben effektiv entfernt werden kann mit einer handelsüblichen Licht emittierende Diode Licht Quelle zu Photobleach die Probe vor Immunostaining.
Abstract
Immunfluoreszenz ist eine gängige Methode, verwendet um subzelluläre Kompartimente zu visualisieren und die Lokalisierung von bestimmten Proteinen innerhalb einer Gewebeprobe bestimmen. Ein großes Hindernis für die Übernahme von Bildern hoher Qualität Immunfluoreszenz ist endogene Autofluoreszenz des Gewebes durch Alterung Pigmente wie Lipofuszin oder gemeinsame Probe Verarbeitungsverfahren wie Aldehyd Fixierung. Dieses Protokoll beschreibt, wie Hintergrundfluoreszenz durch Immunofluoreszenz mit weißem Phosphor lichtemittierende Diode (LED) Arrays vor der Behandlung mit fluoreszierenden Sonden erheblich reduziert werden kann. Die Breitspektrum Emission von weißem Phosphor ermöglichen LEDs in einem Spektrum von Emission Gipfeln des Fluorophore bleichen. Immunofluoreszenz-Apparat aus Standardkomponenten zu sehr geringen Kosten aufgebaut werden kann und bietet eine zugängliche Alternative zu handelsüblichen chemischen stillt. Eine Immunofluoreszenz Vorbehandlung des Gewebes gefolgt von konventionellen Immunfluoreszenz Färbung erzeugt Bilder gratis Hintergrund Autofluoreszenz. Im Vergleich zu chemischen stillt die Sonde sowie Hintergrund reduziert Signale, Immunofluoreszenz Behandlung hatte keinen Einfluss auf Sonde Fluoreszenz-Intensität, während es effektiv Hintergrund und Lipofuszin Fluoreszenz reduziert. Obwohl Immunofluoreszenz mehr Zeit für die Vorbehandlung erfordert, können höhere Intensität LED-Arrays zur Immunofluoreszenz verkürzen. Diese einfache Methode kann potenziell zu einer Vielzahl von Geweben, insbesondere postmitotischen Gewebe, die ansammeln von Lipofuszin wie dem Gehirn und Herz- oder skelettartige Muskeln angewendet werden.
Introduction
Fluoreszenz-Mikroskopie mit Antikörpern, die Ausrichtung auf bestimmte Proteine wird routinemäßig verwendet, um Proteine des Interesses in Zellkultur und Geweben zu visualisieren. Eine schwere Komplikation für den Erwerb der eindeutige und endgültige Bilder in Immunfluoreszenz ist Autofluoreszenz, die endogen im Säugetier-Gewebe durch die Alter Pigment Lipofuszin und Proteine wie Elastin und Kollagen1entstehen können, 2. Andere Quellen der Autofluoreszenz können durch Vorbereitung Beispielschritte z. B. Aldehyd Fixierung3eingeführt werden. Lipofuszin-Granulat, hauptsächlich bestehend aus oxidativ modifizierten Protein- und Lipid-Abbau-Rückstände, reichern sich in langlebigen Zellen mit zunehmendem Alter2. Dies bewirkt, dass Schwierigkeiten im Bereich der bildgebenden postmitotischen Gewebe wie Gehirn und Herz- oder skelettartige Muskeln, wie die Fluoreszenz Emissionsspektrum von Lipofuszin ist breit und variabel, oft zeitgleich mit der Emissionswellenlänge von gemeinsamen Fluorophore verwendet für 4Kennzeichnung. Diese Faktoren machen Bildgebung des menschlichen Hirngewebe von late-Onset neurodegenerativen Erkrankungen wie Frontotemporal lobar Degeneration (FTLD) besonders anspruchsvoll.
Um Autofluoreszenz zu reduzieren, haben wir eine Technik entwickelt, in der wir die Rutsche montiert Gewebeschnitte mit weißem Licht emittierende (LED)-Diodenarray mit einem Haushalt Schreibtisch Lampe5bestrahlen. Diese einfache Technik bietet eine Alternative zu Techniken, mit denen chemische stillt z. B. CuSO4 in Ammoniumacetat, oder im Handel erhältlichen Farbstoffe wie Sudan schwarz-B und Eriochrome Schwarz T6abschrecken. Es hat auch erhebliche Kostenersparnis über multispektralen LED Lampe Immunofluoreszenz Techniken und vermeidet Komplikationen und Artefakte aus digitalen Autofluoreszenz Methoden der Haarentfernung wie spektrale un-Mischen7,8erzeugt. Weißer Phosphor haben LEDs eine breite Emissionsspektrum, hohe Leuchtkraft und niedrige Herstellungskosten, eignen sich ideal als handelsübliche Komponente für Immunofluoreszenz verschiedener Chromophore5,9.
In diesem Protokoll wir zeigen den Bau von einem Immunofluoreszenz-Apparat mit zugänglichen Komponenten und ein Fall von FTLD Gewebe mit Tau-positiver Einschlüsse (FTLD-T) mit einem Antikörper spezifisch für phosphorylierten Tau Immunofluoreszenz zuweisen. Wir zeigen die Wirkung der Immunofluoreszenz Fluoreszent-markierten Antikörpern beschäftigt zwei häufig verwendete Chromophore Imaging: Alexa 488 und Texas Red. Die Wirkung der Immunofluoreszenz im Vergleich zu unbehandelten Abschnitte oder die Behandlung mit einem kommerziellen chemische Quencher werden quantifiziert und verglichen. Diese Vorbehandlung Immunofluoreszenz kann in jedes standard Immunfluoreszenz-Färbung-Protokoll zu Autofluoreszenz in einer biologischen Probe entfernen aufzunehmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Immunofluoreszenz Vorbehandlung des Gewebes in diesem Manuskript beschrieben ermöglicht eine effektive Beseitigung der Autofluoreszenz mit Standardkomponenten. Das Protokoll beschreibt Immunfluoreszenz Bildgebung der phosphorylierten Tau Aggregate in Formalin fixiert menschliche Gehirngewebe mit sekundären Antikörper konjugiert, Alexa 488 und Texas Red mit DAPI als eine nukleare Gegenfärbung. Um die Methode zu anderen Geweben anwenden, empfehlen wir eine 48 h Immunofluoreszenz Vorbehandlung der Probe als Ausgangs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde im ganzen oder in Teilen durch die kanadische Konsortium der Neurodegeneration und Alterung (CCNA), Canadian Institute der Gesundheit Forschung (CIHR), der ALS Society of Canada (ALS Kanada) und der Alzheimer-Gesellschaft von Kanada (ASC) unterstützt. Die Autoren möchten danke Sultan Darvesh und Andrew Reid von der Maritime Brain Tissue Bank für die Bereitstellung der FTLD Hirngewebe Mailand Ganguly aus der räumlich-zeitliche Ausrichtung und Verstärkung der Strahlung Reaktion (STTARR) Programm und seine angeschlossenen Förderorganisationen für Tissue, Einbettung und Dienstleistungen und die erweiterte optische Mikroskopie Facility (AOMF) für die Bereitstellung von Mikroskopie-Instrumente-Schnitt. Kevin Hadley wird für die kritische Durchsicht des Manuskripts gedankt.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin . Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al. Human and rat brain lipofuscin proteome. Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
