蛍光顕微鏡の人間の脳をホルマリン固定組織で背景の蛍光性の単純な除去
Summary
生体試料のバック グラウンド蛍光はしばしば高齢の人間後組織を中心に、蛍光イメージング技術を複雑にします。このプロトコルは、これらのサンプルから蛍光ことができる効果的に削除する方法について説明します photobleach 免疫染色の前にサンプル ソース市販発光ダイオード光を使用します。
Abstract
蛍光は細胞内コンパートメントを可視化する組織サンプル中の特定の蛋白質の局在を決定するために使用する一般的な方法です。高品質の蛍光画像の取得に大きな障害は老化色素リポフスチンなどによって生じたアルデヒド固定などの一般的なサンプル準備プロセスによって組織の内因性蛍光。このプロトコルでは、どのように背景の蛍光性が大幅蛍光プローブと白色蛍光体発光ダイオード (LED) 治療前に配列を使用して退色を軽減できますをについて説明します。白色蛍光体の広域スペクトル発光 Led の放出ピークの範囲にわたって fluorophores の漂白を可能にします。非常に低コストで既製のコンポーネントから構築することができますのフォトブリーチング装置および市販化学消す物にアクセス可能な代替手段を提供しています。従来の蛍光染色に続いて組織の退色の前処理は、バック グラウンド蛍光の無料画像を生成します。に比べてプローブとしてバック グラウンドを低減する化学の消す物を確立する信号をそれは効果的に背景とリポフスチンの蛍光を軽減しながら退色処理いたプローブの蛍光強度に及ぼす影響。退色には、前処理のためのより多くの時間が必要ですが、退色時間を短縮する高輝度 LED アレイが使えます。この簡単な方法は、さまざまな組織、脳などのリポフスチンの蓄積後特に組織や心臓や骨格筋に潜在的適用できます。
Introduction
ターゲット特定の蛋白質の抗体を使用して蛍光顕微鏡は細胞培養や組織に興味の蛋白質を視覚化する使用します。蛍光抗体法で明確かつ決定的な画像の取得に主要な合併症が引き起こされること内生的哺乳類体内年齢色素リポフスチン、エラスチンとコラーゲン1のような蛋白質、蛍光 2。蛍光の他の源をアルデヒド固定3などのサンプル準備の手順を導入できます。主に酸化修飾タンパク質と脂質分解残基から成るリポフスチン顆粒は加齢2長い生きている細胞に蓄積されます。これにより脳や心臓や骨格筋などの後組織イメージングの難しさ、リポフスチンの蛍光発光スペクトルが広い、変数、頻繁に使用される一般的な fluorophores の発光波長に合わせ、4をラベリングします。これらの要因は、特に挑戦的な前頭側頭葉変性症 (FTLD) など晩発性神経変性疾患の例から人間の脳組織のイメージングを作る。
蛍光を減らすためには、我々 は、白色発光ダイオード (LED) 配列家庭用デスク ランプ5を使用するとスライド マウントの切片を照射法を考案しました。この単純なテクニックは、酢酸アンモニウムまたはスーダン黒い B やエリオクロム ブラック T6などの染料を焼入れ市販 CuSO4など化学の消す物を使用する方法に代わるものを提供します。大幅なコスト削減にマルチ スペクトルがあります LED ランプ フォトブリーチング法と合併症や工芸品デジタル蛍光除去方法スペクトル非混合7,8などから生成を回避できます。白色蛍光体 Led ある、広い発光スペクトル、高輝度と低製造コスト、退色様々 な発色団5,9の既製のコンポーネントとして最適です。
このプロトコルでは、アクセス可能なコンポーネントを使用して退色装置の建設を示すし、退色をタウ陽性介在物 (FTLD T) リン酸化タウの特異抗体を使用してを含む FTLD 組織の場合に適用します。2 つの一般的に使用される発色団を用いる蛍光標識抗体をイメージングに退色の影響を示す: アレクサ 488 とテキサス赤。未処理のセクション対退色の影響または商業化学クェンチャーの治療を受けた人は定量化し、比較します。この退色前処理は、生体試料の蛍光を削除する任意の標準的な蛍光汚損のプロトコルに組み込むことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿に記載されている組織のフォトブリーチング前処理は、既製のコンポーネントを使用して蛍光の効果的な除去が可能です。プロトコルでは、アレクサ 488 とテキサス赤、核の対比染色として DAPI の二次抗体を使用して人間の脳をホルマリン固定組織におけるリン酸化タウ凝集体の蛍光イメージングについて説明します。メソッドを適用すると、他の組織に、開始点としてサンプルに 48 h ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究では、カナダのコンソーシアムの神経変性、加齢 (CCNA)、カナダの研究所の健康研究 (機構)、カナダ (ALS)、ALS 協会・ アルツハイマー協会カナダ (ASC) の全体または一部を支えられました。著者はスルタン Darvesh と海上脳組織銀行から FTLD の脳組織を提供するため時空をターゲットと増幅の放射線応答 (STTARR) プログラムおよび関連会社からミラノ グリー Andrew Reid を感謝したいです。埋め込み、区分のサービス、および、高度な光学顕微鏡施設 (AOMF) 顕微鏡の楽器を提供するための組織のための機関の資金調達。ケビン ハドリーは原稿の批判的検討の感謝の意を。
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
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