İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması
Summary
Arka plan autofluorescence biyolojik örneklerin kez Floresans tabanlı görüntüleme teknikleri, özellikle yaşlı insan postmitotic doku zorlaştırmaktadır. Bu protokolü nasıl autofluorescence bu örnekler üzerinden etkin bir şekilde kaldırılabilir açıklar bir ticari olarak mevcut ışık yayan diyot ışık kullanarak örnek immunostaining önce photobleach için kaynak.
Abstract
Ayirt hücre altı bölmeleri görselleştirmek ve doku örneği içinde belirli proteinlerin yerelleştirme belirlemek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Yüksek kaliteli ayirt görüntüler edinimi için büyük bir engel lipofuscin gibi yaşlanma pigmentler veya aldehit fiksasyonu gibi genel örnek hazırlık süreçlerini neden doku endojen autofluorescence var. Bu protokolü nasıl arka plan Floresans büyük ölçüde beyaz fosfor ışık yayan diyot (LED) diziler önce tedavi ile floresan problar kullanarak photobleaching ile giderilebilir açıklar. Beyaz fosfor geniş spektrumlu emisyon LED fluorophores emisyon doruklarına aralığında beyazlatma için izin verir. Photobleaching aparatı çok düşük maliyetle kapalı bileşenlerden oluşturulması ve piyasada bulunan kimyasal quenchers için erişilebilir bir seçenek sunar. Photobleaching ön arıtma geleneksel ayirt boyama tarafından takip doku görüntü arka plan autofluorescence ücretsiz oluşturur. Göre kurulan soruşturma yanı sıra arka plan azaltılmış kimyasal quenchers sinyalleri, photobleaching tedavi etkili arka plan ve lipofuscin floresan azaltılmış sonda floresan yoğunluğu üzerinde bir etkisi vardı. Photobleaching ön arıtma için daha fazla zaman gerektirir, ancak daha yüksek yoğunluklu LED diziler photobleaching süresini azaltmak için kullanılır. Bu basit yöntem doku, beyin gibi lipofuscin birikir özellikle postmitotic doku ve kardiyak veya iskelet kasları çeşitli için potansiyel olarak uygulanır.
Introduction
Floresans mikroskobu antikorlar spesifik proteinlerin hedefleme kullanarak düzenli olarak proteinler hücre kültürü ve dokuların ilgi görselleştirmek için kullanılır. Ayirt açık ve kesin Albümdeki edinimi için büyük bir komplikasyon endogenously memeli dokusunda yaş pigment lipofuscin ve elastin ve kolajen1gibi proteinler tarafından neden olabilir autofluorescence olduğunu, 2. Autofluorescence ile ilgili diğer kaynakları aldehid fiksasyon3gibi örnek hazırlama adımlarda tanıttı olabilir. Lipofuscin granül, öncelikle oxidatively değiştirilmiş protein ve lipit bozulması artıkları, oluşan uzun-canlı hücreler artan yaş2birikir. Olarak lipofuscin floresan emisyon yelpazesi geniş ve değişken, genellikle ortak fluorophores için kullanılan emisyon dalgaboyu ile rastlayan bu beyin ve kalp veya iskelet kasları gibi postmitotic doku Imaging’de zorluğa neden oluyor 4etiketleme. Bu faktörler insan beyin dokusundan özellikle zor durumlarda da lobar dejenerasyonu (FTLD) gibi geç başlangıçlı nörodejeneratif hastalıkların görüntüleme olun.
Autofluorescence azaltmak için içinde biz beyaz bir ışık yayan diyot (LED) dizi bir ev Resepsiyon lamba5kullanarak slayt monte doku bölümleri ışınlatayım bir teknik geliştirmiştir. Bu basit tekniği kullanmak CuSO4 gibi kimyasal quenchers amonyum asetat, veya piyasada bulunan boyalar Sudan Siyah B ve Eriochrome siyah T6gibi Şoklama teknikleri bir alternatif sağlar. Önemli maliyet tasarrufu bitti spektral have LED Lamba photobleaching teknikleri ve komplikasyonlar ve spektral un karıştırma7,8gibi dijital autofluorescence kaldırma yöntemleri üretilen eserlerin önler. Beyaz fosfor photobleaching kromofor5,9çeşitli için kapalı bir bileşeni olarak idealdir geniş emisyon spektrumlu, yüksek parlaklık ve düşük üretim maliyeti, LED var.
Bu iletişim kuralı, biz erişilebilir bileşenler kullanarak bir photobleaching aparatı inşaatı göstermek ve photobleaching FTLD dokusu fosforile tau ilişkin bir antikor özel kullanarak tau-pozitif kapanımlar (FTLD-T) içeren olgusu uygulanır. Biz iki yaygın olarak kullanılan kromofor istihdam fluorescently etiketli antikorlar Imaging üzerindeki etkisi photobleaching göstermek: Alexa 488 ve Texas kırmızı. Photobleaching tedavi edilmeyen bölümleri karşı etkisini veya ticari bir kimyasal içki ile tedavi sayılabilir ve karşılaştırıldığında. Bu photobleaching ön arıtma autofluorescence bir biyolojik örnek kaldırmak için herhangi bir standart ayirt boyama Protokolü içine dahil edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazması açıklanan dokuların photobleaching ön arıtma kapalı bileşenleri kullanarak autofluorescence etkili eleme için sağlar. Protokol ayirt görüntüleme fosforile tau toplamları insan beyninin formalin sabit doku ikincil antikorlar Alexa 488 ve Texas kırmızı, DAPI bir nükleer counterstain olarak Birleşik kullanarak açıklar. Diğer dokulara yöntemi uygulamak için bir başlangıç noktası olarak örnek bir 48 h photobleaching ön arıtma yapmak tavsiye. Photobleaching sonra için iletişim kur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma tamamen veya kısmen Kanada Konsorsiyumu ateş ve yaşlanma (CCNA), Kanada Enstitüsü, Sağlık Araştırma (CIHR), Kanada (ALS Kanada) ALS Derneği ve Alzheimer Derneği Kanada (ASC) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Sultan Darvesh ve Andrew Reid bankadan deniz beyin dokusu FTLD beyin dokuları sağlamak için Milan Ganguly Spatio-Temporal hedefleme ve radyasyon amplifikasyon yanıt (STTARR) programı ve onun bağlı teşekkür etmek istiyorum Ajanslar gömme ve Hizmetleri ve gelişmiş optik mikroskobu tesisi (mikroskopi aletleri sağlamak için AOMF) kesit doku için finansman. Kevin Hadley el yazması kritik inceleme için teşekkür etti.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin . Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al. Human and rat brain lipofuscin proteome. Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
