Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama
Summary
Bir fare modeli enterohemorrhagic bioluminescence etiketli bakteri kullanarak E. coli (EHEC) kolonizasyon için detaylı bir protokol sunulmuştur. Kollarındaki bu bakteriler tarafından bir non-invaziv görüntüleme sistemi içinde canlı hayvan vivo içinde tespiti geçerli anlayışımız EHEC kolonizasyon ilerletebilirsiniz.
Abstract
Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157: H7, hangi o causesdiarrhea, Hemorajik kolit (HS), gıda kaynaklı patojen olduğunu ve hemolitik üremik Sendromu (HUS), kolonize insanlar bağırsak için. EHEC kolonizasyon içinde vivo detaylı mekanizması çalışmaya EHEC kolonizasyon ölçmek ve izlemek için hayvan modelleri olması esastır. Burada bir fare-EHEC kolonizasyon modeli kollarındaki ifade plazmid EHEC izlemek ve yaşam ana EHEC kolonizasyon ölçmek için dönüşüm tarafından göstermektedir. Bioluminescence etiketli EHEC ile aşılanmış hayvanlar yoğun kollarındaki sinyalleri farelerde algılama tarafından görüntüleme sistemi bir non-invaziv vivo içinde ile göstermek. Sonra 1-2 gün enfeksiyon sonrası, kollarındaki sinyalleri hala enfekte hayvanlarda da EHEC konaklarda en az 2 gün için kolonize gösterir tespit edilemedi. Biz de bu kollarındaki EHEC bulun ki fare Bağırsaklarda, özellikle çekum ve iki nokta üst üste, için ex vivo imge–dan göstermek. Bu fare-EHEC kolonizasyon model EHEC kolonizasyon mekanizma mevcut bilgi ilerlemek için bir araç olarak hizmet verebilir.
Introduction
EHEC O157: H7 nedenleri ishal1, HS2, HUS3ve hatta Akut böbrek yetmezliği4 kontamine su veya gıda ile bir patojen var. EHEC patojenik bir enterobacterium olduğunu ve insanların1gastrointestinal sistem colonizes. EHEC ilk uygun zaman ana bağırsak epiteli, kolonizasyon faktörler bir bağlama inducing ve daha sonra zorlamak için (A/E) lezyon effacing moleküler bir şırınga işlev gören tür III salgı sistemi (T3SS) ile ana hücreleri içine enjekte yapışma (kolonizasyon)5. Bu genlerin A/E lezyon oluşumunda yer alan Enterocytes efasman (LEE) patojenitesi ada5locus tarafından kodlanır.
Bioluminescence olduğunu ışık üreten kimyasal reaksiyon, görünür ışık6oluşturmak için onun substrat biyoluminesans hangi luciferase tromboksan. Enzimatik bu işlem genellikle oksijen veya adenozin trifosfat (ATP)6varlığını gerektirir. (BLI) görüntüleme bioluminescence araştırmacılar canlı hayvan7görselleştirme ve ana bilgisayar-patojen etkileşimlerin niceleme sağlar. Saçınıza canlı hayvan bakteriyel enfeksiyon döngüsünde onlar göç ve farklı dokular7istila kollarındaki bakteri izleyerek karakterize olabilir; Bu enfeksiyon dinamik bir ilerleme ortaya koymaktadır. Ayrıca, hayvanlarda bakteri yükü kollarındaki sinyal8‘ e ilişkilidir; Böylece, deneysel hayvan patolojik şartları basit ve doğrudan bir şekilde tahmin etmek için uygun bir göstergedir.
Burada kullanılan plazmid luciferase operon, bakteri, kendi luciferase substrat7,9kodlar Photorhabdus luminescens olan luxCDABE, yer. Bu luciferase ifade plazmid bakteri dönüştürerek, canlı hayvan kollarındaki bu bakteri gözlemleyerek kolonizasyon ve enfeksiyon işlemleri izlenebilir. Genel olarak, alma ve bioluminescence etiketli bakteri araştırmacılar bakteri numaraları ve konumu, bakteriyel canlılığı antibiyotikler/tedavi ve bakteri gen ekspresyonu enfeksiyon/kolonizasyon6, ile izlemek izin 7. çok sayıda patojen bakteri enfeksiyonu onların enfeksiyon döngüsü ve/veya gen ifade incelemek için luxCDABE operon express bildirilmiştir. Bu bakterilerin uropathogenic E. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic de dahil olmak üzere, E. coli (EPEC)8, Sitrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria Monositogenez17, Yersinia enterocolitica18,19, ve Vibrio cholerae20, dokümante edilmiştir.
EHEC kolonizasyon vitro ve in vivo21,22,23çalışma kolaylaştırmak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Ancak, EHEC kolonizasyon vivo içindeçalışmaya uygun hayvan modellerin eksikliği ve böylece ayrıntılar ortaya çıkan bir yetersizliği olduğunu. EHEC kolonizasyon mekanizması vivo içindeçalışma kolaylaştırmak için gözlemlemek ve non-invaziv bir yöntem canlı hayvan EHEC kolonizasyon ölçmek için hayvan modelleri oluşturmak için değerlidir.
Bu el yazması kollarındaki ifade sisteminin EHEC kolonizasyon zaman içinde yaşayan ana bilgisayarları izlemek için kullandığı bir fare-EHEC kolonizasyon modeli açıklar. Fareler intragastrically bioluminescence etiketli EHEC ile aşılanmış ve kollarındaki sinyal farelerde sistem13Imaging bir non-invaziv vivo içinde ile algılanır. Sonra 2 gün sonra 2 gün enfeksiyon sonrası bu bakteri konak bağırsaklarda kolonize önerilen enfeksiyon sonrası önemli kollarındaki sinyalleri onların bağırsaklarda gösterdi EHEC bioluminescence etiketli fareler bulaşmış. Ex vivo görüntü verilerini bu kolonizasyon özellikle çekum ve kolon farelerin olduğunu gösterdi. Bu fare-EHEC modelini kullanarak, kollarındaki EHEC kolonizasyon yaşam ana bilgisayarında bir görüntüleme sistemi daha fazla anlayış teşvik edebilir enterik bakteri kolonizasyonu detaylı mekanizmaları incelemek için in vivo tarafından tespit edilebilir EHEC kaynaklı fizyolojik ve patolojik değişiklikler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu luciferase plazmid ile dönüştürülmüş EHEC onun Yerelleştirme Ana bilgisayarlar veya gen ifade vivo içinde8,11,12incelemek için kullanılan bildirilmiştir. Aşağıda gösterildiği fare modeli ayrıca fare ana bilgisayar8‘ bulmak belgili tanımlık kolonize EHEC zamanlama ve yerelleştirme bildirilmiştir. Yine de, biz, farelere EHEC aşılama intragastrically yönetmek ve kolların…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Chi-Chung Chen üzerinden Bakanlığı tıbbi araştırma, Chi Mei Tıp Merkezi (Tainan, Tayvan) fare yardım için enfeksiyon ve ulusal Cheng Kung Üniversitesi laboratuvar hayvan merkezinden destek anıyoruz. Bu eser bilim Bakanı tarafından desteklenir ve Teknoloji (en) CC için (en 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005) verir.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
References
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90 (2012).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
- Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
- Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
- Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. . Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
- Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82 (2016).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
- Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
- Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
- Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
- Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
- Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977 (2013).
- Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013 (2014).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
- Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud’homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
- Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
- Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
- Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).
