Представлен подробный протокол мыши модели для энтерогеморрагические E. coli (EHEC) колонизации с помощью биолюминесценции меченых бактерий. Обнаружение этих биолюминесцентных бактерий неинвазивные в vivo imaging системы в живых животных можно заранее нашего нынешнего понимания особенностей ЭГКП колонизации.
Энтерогеморрагические E. coli (EHEC) O157: H7, который является пищевых патогенов, causesdiarrhea, геморрагический колит (СС), и гемолитический уремический синдром (ГУС), колонизации кишечного тракта человека. Чтобы изучить подробные механизм ЭГКП колонизации в естественных условиях, важно иметь животных моделей для мониторинга и количественной оценки ЭГКП колонизации. Мы демонстрируем здесь модель колонизации мыши-инфекции ЭГКП, превращая биолюминесцентных выражая плазмиды к инфекции ЭГКП для мониторинга и количественной оценки ЭГКП колонизации в жизни хозяев. Животные привиты с помечены биолюминесценция ЭГКП Показать интенсивной биолюминесцентных сигналов в мышей обнаружения с неинвазивные в vivo imaging системы. После того, как 1 и 2 дней после инфицирования, биолюминесцентных сигналы могут по-прежнему быть обнаружены в зараженных животных, который свидетельствует о том, что ЭГКП колонизировать в hosts для по крайней мере 2 дней. Мы также продемонстрировать, что эти биолюминесцентных ЭГКП locate для мыши кишечника, особенно в слепой кишки и толстой кишки, от ex vivo изображений. Эта модель колонизации мыши ЭГКП может служить в качестве инструмента для продвижения текущий набор знаний о механизме колонизации ЭГКП.
EHEC O157: H7 является возбудителя, который вызывает понос1, HS2, Гус3и4 даже острая почечная недостаточность через загрязненной воды или пищи. ЭГКП является патогенным enterobacterium и колонизирует желудочно-кишечного тракта человека1. Когда впервые ЭГКП придерживаться принимающей кишечного эпителия, они впрыскивают факторов колонизации в клетки хозяина через систему секреции типа III (T3SS), которая функционирует как молекулярные шприц вызывая присоединения и их стирания (A/E) поражения впоследствии для обеспечения адгезия (колонизация)5. Эти гены, участвующих в формировании A/E поражения кодируются Локус энтероцитах самоотречение (ли) патогенности остров5.
Биолюминесценции — свет производителей химическая реакция, в которой Люцифераза катализирует ее люциферин субстрат для создания видимый свет6. Это ферментативный процесс часто требует присутствия кислорода или аденозинтрифосфатом (АТФ)6. Биолюминесценции изображений (BLI) позволяет исследователям визуализации и квантование хост возбудитель взаимодействий в живых животных7. BLI могут характеризовать цикла бактериальной инфекции в живых животных, следуя биолюминесцентных бактерий, как они мигрируют к и вторгнуться в7различных тканей; Это показывает динамический прогрессирования инфекции. Кроме того бактериальной нагрузки в животных связана с биолюминесцентных сигнал8; Таким образом он является удобным показателем для оценки патологических условиях экспериментальных животных в простой и прямой путь.
Плазмиды, здесь содержится Оперон Люцифераза, luxCDABE, который от бактерии Photorhabdus luminescens , который кодирует его собственный Люцифераза субстрата7,9. Путем преобразования этого выражения Люцифераза плазмида в бактерии, колонизации и инфекции процессы может контролироваться путем наблюдать эти биолюминесцентных бактерий в живых животных. В целом BLI и биолюминесценции меченых бактерий позволяют исследователям для мониторинга бактериальных числа и местоположения, бактериальных жизнеспособности с антибиотиков терапии и выражение гена бактериальной инфекции/колонизации6, 7. поступили многочисленных патогенных бактерий, что Экспресс luxCDABE Оперон для изучения их выражение цикла и/или гена инфекции в инфекции. Эти бактерии, включая uropathogenic E. coli10, ЭГКП8,11,12,13, энтеропатогенные E. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, и холерный вибрион20, документально подтверждены.
Некоторые экспериментальные модели были разработаны для содействия изучению колонизации ЭГКП in vitro и in vivo22,–21,23. Однако есть отсутствие подходящих животных моделей для изучения ЭГКП колонизации в естественных условияхи, таким образом, результирующая нехватка деталей. Чтобы облегчить изучение ЭГКП колонизации механизм в естественных условиях, он ценен для построения животных моделей для наблюдения и количественно ЭГКП колонизации в живых животных неинвазивным методом.
Эта рукопись описывает модель колонизации мыши-инфекции ЭГКП, которая использует систему биолюминесцентных выражая для мониторинга ЭГКП колонизации со временем в жизни хозяев. Мышей intragastrically привиты с помечены биолюминесценция ЭГКП и биолюминесцентных сигнала в мышах с неинвазивные в vivo imaging системы13. Мышей, инфицированных биолюминесценции меченых ЭГКП, показали значительные биолюминесцентных сигналов в их intestine после 2 дней после инфекции, которая предлагает что эти бактерии колонизировали в кишечнике хоста через 2 дня после заражения. Ex vivo данные изображения показали, что этот колонизации специально в слепой кишки и толстой кишки мышей. С помощью этой модели мыши-инфекции ЭГКП, биолюминесцентных колонизации ЭГКП могут быть обнаружены в узле жизни в естественных условиях imaging системы, чтобы изучить подробные механизмы колонизации кишечных бактерий, которые могут способствовать дальнейшему пониманию в ЭГКП индуцированной физиологические и патологические изменения.
Сообщается, что ЭГКП преобразована с Люцифераза плазмида была использована для изучения его локализации в hosts или выражение гена в vivo8,,1112. Для обнаружения инфекции ЭГКП колонизировали сроков и локализации в мышиных хост8…
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем Чи-Чун Чен из департамента медицинских исследований, Chi Mei медицинский центр (Тайнань, Тайвань) за помощь в мыши, инфекции, а также поддержку от лабораторных животных центра национального университета Cheng Kung. Эта работа поддерживается министра науки и технологии (большинство) предоставляет CC (наиболее 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006–011,-005 and106-2321-B-006).
Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
pBSL180 | source of nptII gene | ||
pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
lab coat, gloves | for personnel protection | ||
isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
surgical scissors | use for mice experiment | ||
Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |