Summary

Обнаружение энтерогеморрагические Escherichia Coli колонизации в мышиных принимающей системой неинвазивные в Vivo биолюминесценции

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

Представлен подробный протокол мыши модели для энтерогеморрагические E. coli (EHEC) колонизации с помощью биолюминесценции меченых бактерий. Обнаружение этих биолюминесцентных бактерий неинвазивные в vivo imaging системы в живых животных можно заранее нашего нынешнего понимания особенностей ЭГКП колонизации.

Abstract

Энтерогеморрагические E. coli (EHEC) O157: H7, который является пищевых патогенов, causesdiarrhea, геморрагический колит (СС), и гемолитический уремический синдром (ГУС), колонизации кишечного тракта человека. Чтобы изучить подробные механизм ЭГКП колонизации в естественных условиях, важно иметь животных моделей для мониторинга и количественной оценки ЭГКП колонизации. Мы демонстрируем здесь модель колонизации мыши-инфекции ЭГКП, превращая биолюминесцентных выражая плазмиды к инфекции ЭГКП для мониторинга и количественной оценки ЭГКП колонизации в жизни хозяев. Животные привиты с помечены биолюминесценция ЭГКП Показать интенсивной биолюминесцентных сигналов в мышей обнаружения с неинвазивные в vivo imaging системы. После того, как 1 и 2 дней после инфицирования, биолюминесцентных сигналы могут по-прежнему быть обнаружены в зараженных животных, который свидетельствует о том, что ЭГКП колонизировать в hosts для по крайней мере 2 дней. Мы также продемонстрировать, что эти биолюминесцентных ЭГКП locate для мыши кишечника, особенно в слепой кишки и толстой кишки, от ex vivo изображений. Эта модель колонизации мыши ЭГКП может служить в качестве инструмента для продвижения текущий набор знаний о механизме колонизации ЭГКП.

Introduction

EHEC O157: H7 является возбудителя, который вызывает понос1, HS2, Гус3и4 даже острая почечная недостаточность через загрязненной воды или пищи. ЭГКП является патогенным enterobacterium и колонизирует желудочно-кишечного тракта человека1. Когда впервые ЭГКП придерживаться принимающей кишечного эпителия, они впрыскивают факторов колонизации в клетки хозяина через систему секреции типа III (T3SS), которая функционирует как молекулярные шприц вызывая присоединения и их стирания (A/E) поражения впоследствии для обеспечения адгезия (колонизация)5. Эти гены, участвующих в формировании A/E поражения кодируются Локус энтероцитах самоотречение (ли) патогенности остров5.

Биолюминесценции — свет производителей химическая реакция, в которой Люцифераза катализирует ее люциферин субстрат для создания видимый свет6. Это ферментативный процесс часто требует присутствия кислорода или аденозинтрифосфатом (АТФ)6. Биолюминесценции изображений (BLI) позволяет исследователям визуализации и квантование хост возбудитель взаимодействий в живых животных7. BLI могут характеризовать цикла бактериальной инфекции в живых животных, следуя биолюминесцентных бактерий, как они мигрируют к и вторгнуться в7различных тканей; Это показывает динамический прогрессирования инфекции. Кроме того бактериальной нагрузки в животных связана с биолюминесцентных сигнал8; Таким образом он является удобным показателем для оценки патологических условиях экспериментальных животных в простой и прямой путь.

Плазмиды, здесь содержится Оперон Люцифераза, luxCDABE, который от бактерии Photorhabdus luminescens , который кодирует его собственный Люцифераза субстрата7,9. Путем преобразования этого выражения Люцифераза плазмида в бактерии, колонизации и инфекции процессы может контролироваться путем наблюдать эти биолюминесцентных бактерий в живых животных. В целом BLI и биолюминесценции меченых бактерий позволяют исследователям для мониторинга бактериальных числа и местоположения, бактериальных жизнеспособности с антибиотиков терапии и выражение гена бактериальной инфекции/колонизации6, 7. поступили многочисленных патогенных бактерий, что Экспресс luxCDABE Оперон для изучения их выражение цикла и/или гена инфекции в инфекции. Эти бактерии, включая uropathogenic E. coli10, ЭГКП8,11,12,13, энтеропатогенные E. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, и холерный вибрион20, документально подтверждены.

Некоторые экспериментальные модели были разработаны для содействия изучению колонизации ЭГКП in vitro и in vivo22,21,23. Однако есть отсутствие подходящих животных моделей для изучения ЭГКП колонизации в естественных условияхи, таким образом, результирующая нехватка деталей. Чтобы облегчить изучение ЭГКП колонизации механизм в естественных условиях, он ценен для построения животных моделей для наблюдения и количественно ЭГКП колонизации в живых животных неинвазивным методом.

Эта рукопись описывает модель колонизации мыши-инфекции ЭГКП, которая использует систему биолюминесцентных выражая для мониторинга ЭГКП колонизации со временем в жизни хозяев. Мышей intragastrically привиты с помечены биолюминесценция ЭГКП и биолюминесцентных сигнала в мышах с неинвазивные в vivo imaging системы13. Мышей, инфицированных биолюминесценции меченых ЭГКП, показали значительные биолюминесцентных сигналов в их intestine после 2 дней после инфекции, которая предлагает что эти бактерии колонизировали в кишечнике хоста через 2 дня после заражения. Ex vivo данные изображения показали, что этот колонизации специально в слепой кишки и толстой кишки мышей. С помощью этой модели мыши-инфекции ЭГКП, биолюминесцентных колонизации ЭГКП могут быть обнаружены в узле жизни в естественных условиях imaging системы, чтобы изучить подробные механизмы колонизации кишечных бактерий, которые могут способствовать дальнейшему пониманию в ЭГКП индуцированной физиологические и патологические изменения.

Protocol

Предупреждение: EHEC O157: H7 представляет собой биобезопасности уровня 2 (BSL-2) возбудителя по данным центров по контролю над заболеваниями и профилактике (CDC) Инструкция по биобезопасности (https://www.cdc.gov/). Таким образом должны выполняться все экспериментальные процедуры с участием ЭГКП в объек…

Representative Results

Мы ведении помечены биолюминесценция ЭГКП (~ 109 бактериальной клетки) для 6 – неделю старых самок мышей C57BL/6 пероральная затравка. После устного прививка ЭГКП мышам в течение 1 ч животные были рассмотрены биолюминесцентных сигнала система электронного фотографиро…

Discussion

Сообщается, что ЭГКП преобразована с Люцифераза плазмида была использована для изучения его локализации в hosts или выражение гена в vivo8,,1112. Для обнаружения инфекции ЭГКП колонизировали сроков и локализации в мышиных хост8…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем Чи-Чун Чен из департамента медицинских исследований, Chi Mei медицинский центр (Тайнань, Тайвань) за помощь в мыши, инфекции, а также поддержку от лабораторных животных центра национального университета Cheng Kung. Эта работа поддерживается министра науки и технологии (большинство) предоставляет CC (наиболее 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006–011,-005 and106-2321-B-006).

Materials

Shaker incubator YIH DER LM-570R bacteria incubation 
Orbital shaking incubator FIRSTEK S300 bacteria incubation 
pBSL180 source of nptII gene
pAKlux2 source of luxCDABE operon
T&A Cloning Kit Yeastern Biotech FYC001-20P use for TA cloning 
Nsi I NEB R0127S use for plasmid cloning 
Sca I NEB R0122S use for plasmid cloning 
Spe I-HF NEB R0133S use for plasmid cloning 
Sma NEB R0141S use for plasmid cloning 
T4 ligase NEB M0202S use for plasmid cloning 
Ex Taq TaKaRa RR001A use for PCR amplification
10X Ex Taq Buffer TaKaRa RR001A use for PCR amplification
dNTP Mixture  TaKaRa RR001A use for PCR amplification
PCR machine applied Biosystem  2720 thermal cycler   for PCR amplification
Glycerol SIGMA G5516-1L use for bacteria stocking solution
NaCl Sigma 31434-5KG-R chemical for making LB medium, 10 g/L
Tryptone CONDA pronadisa Cat 1612.00 chemical for making LB medium, 10 g/L
Yeast Extract powder Affymetrix 23547-1 KG chemical for making LB medium, 5 g/L
Agar CONDA pronadisa Cat 1802.00 chemical for making LB agar
kanamycin  Sigma K4000-5G antibiotics, use for seleciton
streptomycin  Sigma S6501-100G antibiotics, eliminate the microbiota in mice
EDL933 competent cell Homemade method is on supplemental document 
Electroporator MicroPulser for electroporation
Electroporation Cuvettes Gene Pulser/MicroPulser 1652086 for electroporation
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti, J-26S XP use for centrifuging bacteria 
Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter JA25.5 use for centrifuging bacteria 
Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter JLA10.5 use for centrifuging bacteria 
centrifuge bottles Beckman Coulter REF357003 use for centrifuging bacteria 
centrifuge bottles Thermo Fisher scientific 3141-0500 use for centrifuging bacteria 
eppendorf biophotometer plus  eppendorf AG 22331 hamburg for measuring the OD600 value of bacteria
C57BL/6 mice  Laboratory Animal Center of NCKU
lab coat, gloves for personnel protection 
isoflurane  Panion & BF Biotech Inc. G-8669 for mice anesthesia, pharmaceutical grade
1ml syringe  use for oral gavage of mice
Reusable 22 G ball-tipped feeding needle φ0.9 mm X L 50 mm use for oral gavage of mice
surgical  scissors  use for mice experiment
Xenogen IVIS 200 imaging system Perkin Elmer IVIS spectrum use for bioluminescent image capture 
Living Image Software Perkin Elmer version 4.1 use for quantifying the image data

References

  1. Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
  2. Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
  3. Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
  4. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  5. Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90 (2012).
  6. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
  7. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  8. Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
  9. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
  10. Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
  11. Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
  12. Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. . Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
  13. Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82 (2016).
  14. Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
  15. Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
  16. Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  17. Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
  18. Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
  19. Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
  20. Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
  21. Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977 (2013).
  22. Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013 (2014).
  23. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
  24. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  25. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  26. Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud’homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
  27. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  28. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
  29. Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
  30. Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
  31. Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
  32. Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
  33. Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  34. Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
  35. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  36. Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).

Play Video

Cite This Article
Kuo, C., Wang, S., Chen, C. Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System. J. Vis. Exp. (134), e56169, doi:10.3791/56169 (2018).

View Video