Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem
Summary
Een gedetailleerd protocol voor een muismodel voor enterohemorrhagic E. coli (EHEC) kolonisatie met behulp van bacteriën bioluminescentie-label wordt gepresenteerd. Het opsporen van deze bioluminescente bacterie door een niet-invasieve in vivo imaging systeem in levende dieren kan verder ons huidige begrip van EHEC kolonisatie.
Abstract
Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, die is een foodborne ziekteverwekker die causesdiarrhea, hemorragische colitis (HS), en hemolytische uremisch syndroom (HUS), koloniseren aan het darmkanaal van de mens. Om te studeren het gedetailleerde mechanisme van EHEC kolonisatie in vivo is het essentieel dat dierlijke modellen te controleren en te kwantificeren EHEC kolonisatie. Wij tonen hier een muis-EHEC kolonisatie model door de bioluminescente waarin plasmide naar EHEC kwantificeren EHEC kolonisatie in levende hosts te controleren om te zetten. Dieren geënt met bioluminescentie-geëtiketteerden EHEC Toon intens bioluminescente signalen in muizen door detectie met een niet-invasieve in vivo imaging systeem. Na 1 tot 2 dagen boeken van infectie, kunnen bioluminescente signalen nog worden gedetecteerd in besmette dieren, die suggereert dat de EHEC koloniseren in hosts gedurende ten minste 2 dagen. We laten ook zien dat deze bioluminescente EHEC vinden aan muis darm, specifiek in de blindedarm en dikke darm, van ex vivo afbeeldingen. Deze muis-EHEC kolonisatie model kan dienen als een instrument om de huidige kennis van de EHEC kolonisatie mechanisme vooruit te gaan.
Introduction
EHEC-O157:H7 is een ziekteverwekker die diarree1HS2, HUS3, en zelfs acuut nierfalen4 via besmet water of voedsel veroorzaakt. EHEC is een pathogene enterobacterium en koloniseert aan het maag-darmkanaal van de mens1. Wanneer EHEC eerst voldoen aan host intestinaal epitheel, injecteren ze de kolonisatie factoren gastheer cellen via het type III secretie systeem (T3SS), die fungeert als een moleculaire spuit inducerende een koppelen en uitwissen (A/E) laesie om vervolgens af te dwingen hechting (kolonisatie)5. Deze genen die betrokken zijn bij de vorming van de A/E laesie worden gecodeerd door de locus van enterocyte geweest (LEE) pathogeniteit eiland5.
Bioluminescentie is een licht-producerende chemische reactie, in welke luciferase katalyseert de luciferine substraat voor het genereren van zichtbaar licht6. Deze enzymatische proces vereist vaak de aanwezigheid van zuurstof of adenosinetrifosfaat (ATP)6. Bioluminescentie imaging (BLI) kan onderzoekers de visualisatie en de kwantisatie van gastheer-pathogeen interacties in levende dieren7. BLI kan het karakteriseren van de cyclus van de bacteriële infectie in levende dieren door de bioluminescente bacterie te volgen als ze naar migreren en het binnenvallen van de verschillende weefsels en7; Dit blijkt een dynamische progressie van de infectie. Bovendien, de bacteriële belasting bij dieren is gerelateerd aan de bioluminescente signaal8; Dus, het is een handige indicator om te schatten van de pathologische condities van proefdieren in een eenvoudige en directe manier.
Het plasmide gebruikt hier bevatte het luciferase operon, luxCDABE, die is van de bacterie Photorhabdus luminescens dat eigen luciferase substraat7,9 codeert. Door het omzetten van deze plasmide luciferase-uitdrukken in bacteriën, kunnen de kolonisatie en infectie processen worden gecontroleerd door het observeren van deze bioluminescente bacterie in levende dieren. Globaal, BLI en bioluminescentie-geëtiketteerden bacteriën kunnen onderzoekers om te controleren de bacteriële getallen en de locatie, de bacteriële levensvatbaarheid met antibiotica/therapie behandeling en bacteriële genexpressie in infectie/kolonisatie6, 7. talrijke pathogene bacteriën hebben gemeld dat het luxCDABE -operon te onderzoeken hun infectie cyclus en/of gen expressie in infectie express. Deze bacteriën, inclusief uropathogenic E. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic E. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, en Vibrio cholerae20, zijn gedocumenteerd.
Verschillende experimentele modellen zijn ontwikkeld ter vergemakkelijking van de studie van EHEC kolonisatie in vitro en in vivo21,22,23. Er is echter een gebrek aan geschikte dierlijke modellen om te studeren de EHEC kolonisatie in vivo, en dus een daaruit voortvloeiende gebrek aan details. Ter vergemakkelijking van de studie van de EHEC kolonisatie mechanisme in vivo, is het waardevol om te bouwen van diermodellen om te observeren en te kwantificeren EHEC kolonisatie in levende dieren in een niet-invasieve methode.
Dit manuscript beschrijft een muis-EHEC kolonisatie model dat een bioluminescente waarin systeem gebruikt om te controleren EHEC kolonisatie na verloop van tijd in levende hosts. Muizen zijn intragastrically geënt met EHEC bioluminescentie-label en de bioluminescente signaal is gevonden in muizen met een niet-invasieve in vivo imaging systeem13. Muizen geïnfecteerd met bioluminescentie-geëtiketteerden EHEC toonde significante bioluminescente signalen in hun darm na 2 dagen boeken van infectie, die suggereerde dat deze bacteriën in de darm host gekoloniseerd, na 2 dagen boeken van infectie. Ex vivo afbeeldingsgegevens toonde aan dat deze kolonisatie specifiek in de blindedarm en dikke darm van muizen. Met behulp van deze muis-EHEC-model, kan de bioluminescente EHEC-kolonisatie in de levende gastheer worden gedetecteerd door een in vivo imaging systeem, om te bestuderen van de precieze werking van de darmen bacteriën kolonisatie, die verder inzicht in kan bevorderen EHEC-geïnduceerde fysiologische en pathologische veranderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er werd gemeld dat EHEC getransformeerd met luciferase plasmide is gebruikt om te onderzoeken van de lokalisatie in de hosts of gen expressie in vivo8,11,12. De lymfkliertest model hier gedemonstreerd heeft ook gemeld om te ontdekken de EHEC gekoloniseerd timing en localisatie in lymfkliertest host8. Niettemin, wij bieden het detail protocol van hoe EHEC inoculatie met muizen intragastrically beh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen Chi-Chung Chen van het departement van medische Research, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) voor de hulp in muis infectie, en de steun van het laboratorium dierlijke midden van nationale Cheng Kung Universiteit. Dit werk wordt ondersteund door de Minister van wetenschap en technologie (MOST) verleent (meest 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006–011, and106-2321-B-006-005) tot CC.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
References
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90 (2012).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
- Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
- Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
- Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. . Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
- Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82 (2016).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
- Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
- Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
- Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
- Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
- Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977 (2013).
- Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013 (2014).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
- Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud’homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
- Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
- Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
- Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).
