Summary

Nitrógeno cavitación y centrifugación diferencial permite el monitoreo de la distribución periférica de proteínas de membrana en células cultivadas

Published: August 18, 2017
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Summary

Aquí presentamos los protocolos para la homogeneización de detergente libre de células de mamíferos cultivadas basado en nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Este método es ideal para el monitoreo de la partición de proteínas periféricas de membrana entre soluble y fracciones de la membrana.

Abstract

Las células cultivadas son útiles para estudiar la distribución subcelular de proteínas, incluyendo proteínas de membrana periférica. Codificada genéticamente fluorescente etiquetadas proteínas han revolucionado el estudio de la distribución subcelular de la proteína. Sin embargo, es difícil cuantificar la distribución con microscopia fluorescente, especialmente cuando las proteínas son parcialmente citosólicas. Por otra parte, a menudo es importante para el estudio de proteínas endógenas. Bioquímicos de ensayos como immunoblots siguen siendo el estándar de oro para la cuantificación de la distribución de la proteína después de fraccionamiento subcelular. Aunque existen kits comerciales que tienen como objetivo aislar citosólica o ciertas fracciones de la membrana, la mayoría de estos kits se basa en la extracción con detergentes, que puede ser inadecuado para el estudio de proteínas de membrana periférica que se extraen fácilmente las membranas. Aquí presentamos un protocolo libre de detergente para celular homogeneización por nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Confirman la separación de orgánulos subcelulares en soluble y fracciones de pellets a través de diferentes tipos de células y comparar la extracción de proteínas entre varios métodos de homogeneización mecánica no-base de detergente común. Entre varias ventajas de nitrógeno la cavitación es la superior eficacia de disrupción celular con daño mínimo de físico y químico delicada organelos. Combinado con ultracentrifugación, nitrógeno la cavitación es un método excelente para examinar el cambio de las proteínas periféricas de membrana entre citosólica y fracciones de la membrana.

Introduction

Proteínas celulares se pueden dividir en dos clases: los que están asociados a membranas y aquellos que no son. No-membrana las proteínas asociadas se encuentran en el citosol, nucleoplasia y lumina de orgánulos como el retículo endoplásmico (ER). Hay dos clases de proteínas asociadas a membrana, integrales y periféricas. Proteínas integrales de membrana también son conocidas como proteínas transmembranales porque uno o más segmentos de la cadena polipeptídica atraviesa la membrana, por lo general como una α-hélice compuesta de aminoácidos hidrofóbicos. Proteínas transmembranales co-translationally se insertan en las membranas en el curso de su biosíntesis y permanecerán así configuradas hasta que catabolizan. Proteínas de la membrana periférica secundario son conducidas a las membranas, generalmente como consecuencia de la modificación poste-de translación con moléculas hidrofóbicas como los lípidos. En contraste con las proteínas de membrana integral, la Asociación de las proteínas periféricas de membrana con las membranas celulares es reversible y puede ser regulada. Muchos periférica de membrana proteínas función en vías de señalización y asociación regulada con membranas es uno de los mecanismos de activación o inhibición de una vía. Un ejemplo de una molécula de señalización que es una proteína periférica de membrana es la pequeña GTPasa, RAS. Después de una serie de modificaciones post-traduccionales que incluyen modificación con un lípido farnesil, el c-término modificado de una proteína madura de RAS inserta en el folleto de citoplásmico de la membrana celular. En concreto, la membrana plasmática es donde el RAS se dedica a su efector downstream RAF1. Para evitar la activación constitutiva de vía de mitógeno-activada proteína quinasa (MAPK), varios niveles de control de RAS están en lugar. Además de renderización RAS inactivo por hidrolizando GTP en PIB, RAS activa también se puede lanzar desde la membrana plasmática por modificaciones o interacciones con factores para inhibir la señalización de solubilización. Aunque la proyección de imagen vivo fluorescente ofrece a biólogos de célula la oportunidad de observar la localización subcelular de fluorescente etiquetado proteína periférica de membrana proteínas1, existe una necesidad crítica para evaluar la Asociación de la membrana de proteínas endógenas semi-cuantitativamente con enfoques bioquímicos simples.

La evaluación bioquímica adecuada de proteína repartir entre fracciones solubles y de membrana es críticamente dependiente de dos factores: celular homogeneización y eficiente separación de fracciones solubles y de membrana. Aunque algunos de los protocolos, incluyendo los kits comercializados más utilizados, dependen de homogeneización de la célula base de detergente, estos métodos pueden confundir análisis mediante la extracción de proteínas de la membrana en la fase soluble2. Por consiguiente, no detergente mecánicos, basado en métodos de disrupción celular proporcionan resultados limpiador. Existen varios métodos de interrupción mecánica de células cultivadas en cultivo o cosecha de sangre o de órganos. Estos incluyen Dounce homogeneización, interrupción de fina de la aguja, rodamientos de bolas homogeneización, sonicación y cavitación de nitrógeno. Aquí evaluamos cavitación de nitrógeno y se compara con otros métodos. Cavitación de nitrógeno depende del nitrógeno que está disuelto en el citoplasma de las células bajo alta presión. Después de equilibrar, la suspensión de células se expone bruscamente a la presión atmosférica que burbujas de nitrógeno se forman en el citoplasma que rasgar abierto la célula como consecuencia de su efervescencia. Si la presión es suficientemente alta, efervescencia de nitrógeno puede perturbar el núcleo3 y membrana destino organelos como lisosomas4. Sin embargo, si la presión se mantiene lo suficientemente baja, la descompresión alteran la membrana plasmática y ER pero no otros organelos, derramando así citosol y orgánulos citoplásmicos intactos en el homogeneizado que se señala el cavitate5. Por esta razón, la cavitación de nitrógeno es el método de elección para aislar organelos como lisosomas y mitocondrias.

Sin embargo, también es una excelente manera de preparar un homogeneizado que puede ser fácilmente separado en fracciones solubles y de membrana. El recipiente del reactor (de aquí en adelante llamado “la bomba”) usado durante la cavitación consiste en una carcasa de acero inoxidable grueso que soporta alta presión, con una entrada para la entrega del gas nitrógeno desde un tanque y un puerto de salida con una válvula de descarga ajustable.

Cavitación de nitrógeno se ha utilizado para la homogeneización de la célula desde la década de 19606. En 1961, cazador y Commerfold7 estableció cavitación de nitrógeno como una opción viable para la interrupción de tejidos de mamíferos. Desde entonces, los investigadores han adaptado la técnica a diferentes células y tejidos con éxito y cavitación de nitrógeno se ha convertido en una grapa en múltiples aplicaciones, incluyendo membrana preparación8,9, núcleos y organelas preparación10,11y extracción bioquímica lábil. En la actualidad, biólogos de la célula más a menudo emplean otros métodos de homogeneización de la célula porque las ventajas de la homogeneización de nitrógeno no han sido ampliamente anunciadas, bombas de nitrógeno son caras y hay una idea errónea de que un número relativamente grande de células es Obligatorio. No se han publicado protocolos para la cavitación de nitrógeno alcanzar homogenados sin células con núcleos intactos, y en evaluaciones más publicadas se utilizaron volúmenes de 20 mL de la suspensión celular. Para adaptar esta técnica clásica para los requerimientos actuales de trabajar con muestras pequeñas, presentamos un protocolo modificado de cavitación de nitrógeno diseñado específicamente para las células cultivadas. Después de la cavitación del nitrógeno, el homogenado se separa en fracciones de membrana (P) y soluble (S) por centrifugación diferencial, primero con un exprimido a velocidad baja para extraer los núcleos y células intactas y luego con un exprimido a alta velocidad (> 100.000 x g) para separar membranas de la fracción soluble. Analizar la eficiencia de la separación con los immunoblots y comparar cavitación de nitrógeno con otras técnicas de interrupción mecánica. También investigamos el efecto osmótico de buffer de homogenización durante la cavitación de nitrógeno.

Protocol

1. buffer y preparaciones de equipo enfriar 45 mL celular interrupción bombas, tubos de 15 mL y tubos de ultracentrifugación a 4 ° C. Preparación y 25 mL de buffer de homogenización por 2 x 10 7 células a 4 ° C. agregar una proteasa inhibidor tableta antes de uso. Nota: Reservas de homogeneización normalmente contienen KCl en vez de NaCl para mejor reflejar la composición sal intracelular. Buffer de homogeneización utilizado en este protocolo se compone de 10 mM HEPES, pH …

Representative Results

La figura 2 muestra la partición de proteínas celulares del PNS en la fracción citosólica soluble (S) o fracción de la pelotilla de membrana (P). Examinamos tres líneas de células representativas de diferentes tipos de células: HEK-293 (epiteliales), NIH-3T3 (fibroblastos) y Jurkat (linfocito). Inhibidores de disociación de guanina de Rho (RhoGDI) y receptor de manosa-6-fosfato catión independiente (CIMPR) fueron utilizados como controles positivos …

Discussion

Son múltiples las ventajas de la cavitación de nitrógeno sobre otros métodos de alteración mecánica. Quizás el beneficio más significativo es su capacidad para suavemente y eficientemente homogeneizar a muestras. Los principios físicos de descompresión enfría muestras en lugar de generar daño de calentamiento local como ultrasonidos y fricción/cizallamiento basado en técnicas. La cavitación también es extremadamente eficaz en alterar la membrana plasmática. Porque el nitrógeno de las burbujas se generan…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por GM055279, CA116034 y CA163489.

Materials

Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

References

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
  3. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
  4. Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
  5. Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
  6. Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
  7. Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
  8. Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
  9. Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
  10. Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
  11. Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
  12. Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
  13. Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
  14. Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
  15. Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
  16. Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
  17. Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
  18. Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).

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Cite This Article
Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

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