التجويف النيتروجين والطرد المركزي التفاضلي يسمح بمراقبة توزيع البروتينات الغشاء المحيطي في الخلايا المستزرعة
Summary
نقدم هنا البروتوكولات لتجانس خلايا الثدييات مثقف استناداً إلى التجويف النيتروجين وفصل اللاحقة للبروتينات سيتوسوليك والغشاء زمنياً تنبيذ فائق خالية من المنظفات. هذا الأسلوب مثالي لرصد تقسيم البروتينات الغشاء المحيطي بين الذوبان والغشاء الكسور.
Abstract
الخلايا المستزرعة مفيدة لدراسة توزيع سوبسيلولار من البروتينات، بما في ذلك البروتينات الغشاء المحيطية. وراثيا ترميز فلوريسسينتلي البروتينات المعلمة قد أحدثت ثورة في دراسة توزيع البروتين سوبسيلولار. ومع ذلك، من الصعب قياس التوزيع مع مجهر فلوري، خاصة عندما تكون البروتينات جزئيا سيتوسوليك. وعلاوة على ذلك، من المهم كثيرا ما لدراسة البروتينات الذاتية. فحوصات الكيمياء مثل إيمونوبلوتس يظل المعيار الذهبي للتحديد الكمي لتوزيع البروتين بعد تجزئة سوبسيلولار. على الرغم من أن هناك مجموعات تجارية تهدف إلى عزل سيتوسوليك أو بعض الكسور غشاء، أن معظم هذه مجموعات تستند إلى استخراج مع المنظفات والتي قد تكون غير ملائمة لدراسة البروتينات الغشاء الطرفية التي يتم استخراجها بسهولة من الأغشية. هنا نقدم بروتوكول خالية من المنظفات لتجانس الخلوية التجويف النيتروجين وفصل اللاحقة للبروتينات سيتوسوليك والغشاء زمنياً حسب تنبيذ فائق. علينا تأكيد الفصل بين العضيات سوبسيلولار في الذوبان والكسور بيليه عبر أنواع مختلفة من الخلايا، ومقارنة استخراج البروتين بين عدة أساليب غير المستندة إلى المنظفات الميكانيكية التجانس المشترك. من بين العديد من المزايا للنيتروجين هو التجويف كفاءة متفوقة من انقطاع الهاتف الخلوي مع الحد الأدنى من الأضرار المادية والكيميائية إلى العضيات الدقيقة. جنبا إلى جنب مع تنبيذ فائق، التجويف النيتروجين وسيلة ممتازة لدراسة تحول البروتينات الغشاء المحيطي بين سيتوسوليك والغشاء الكسور.
Introduction
البروتينات الخلوية يمكن أن تقسم إلى فئتين: تلك التي ترتبط بالأغشية وتلك التي لا. تم العثور على عدم غشاء البروتينات المرتبطة بها في سيتوسول ونوكليوبلاسم ولومينا من العضيات مثل هيولى (ER). وهناك فئتان من البروتينات المرتبطة بالغشاء، لا يتجزأ، والأجهزة الطرفية. بروتينات الغشاء لا يتجزأ من المعروف أيضا البروتينات transmembrane لأن الأجزاء واحد أو أكثر في سلسلة ببتيد يمتد الغشاء، عادة α-الحلزون تتألف من الأحماض الأمينية مسعور. يتم إدراج كوترانسلاتيونالي في الأغشية أثناء التركيب الحيوي البروتينات transmembrane وتبقى حتى تم تكوينه حتى أنها هي كاتابوليزيد. بروتينات الغشاء المحيطي ثانوياً مدفوعة للأغشية، وعادة ما تكون نتيجة للتعديل بوستترانسلاشونال مع جزيئات مسعور مثل الدهون. وعلى النقيض من البروتينات الغشاء لا يتجزأ، ورابطة بروتينات الغشاء المحيطي مع الأغشية الخلوية يتم عكسها ويمكن أن تنظم. العديد من وظيفة البروتينات الغشاء المحيطي في مسارات الإشارات، وتنظم رابطة مع الأغشية إليه واحدة لتنشيط أو تثبيط طريقا. مثال واحد من جزيء مما يشير إلى أنه بروتين غشاء المحيطي هو GTPase الصغيرة، RAS. بعد سلسلة من التعديلات بوستترانسلاشونال التي تشمل التعديل مع دهن farnesyl، إدراج تعديل ج-المحطة من البروتين RAS ناضجة في النشرة هيولى من الغشاء الخلوي. على وجه التحديد، غشاء البلازما حيث يشرك RAS به المستجيب المتلقين للمعلومات RAF1. لمنع التنشيط التأسيسي لمسار mitogen تنشيط بروتين كيناز (MAPK)، توجد عدة مستويات للسيطرة على رأس. إلى جانب تقديم رأس نشط بالترشيح أنشئ في الناتج المحلي الإجمالي، RAS نشطة أيضا يمكن أن يفرج عن من غشاء البلازما بالتعديلات أو التفاعلات مع سولوبيليزينج عوامل تحول دون إشارة. على الرغم من أن يتيح تصوير لايف الفلورسنت علماء الأحياء الخلية فرصة مراقبة التعريب سوبسيلولار من البروتينات الفلورية غشاء الطرفية معلم البروتين1، لا تزال هناك حاجة ماسة إلى تقييم رابطة الغشاء البروتينات الذاتية شبه كمي مع النهج البيوكيميائية بسيطة.
التقييم البيوكيميائية السليم للبروتين التقسيم بين الغشاء والكسور القابلة للذوبان يتوقف بصورة حاسمة على عاملين اثنين هما: التجانس الخلوية وكفاءة فصل الغشاء وكسور قابلة للذوبان. على الرغم من أن بعض البروتوكولات، بما في ذلك مجموعات الأكثر استخداماً تجارياً، يعتمد على تجانس الخلية المستندة المنظفات، يمكن أن تعتم هذه الأساليب التحليل باستخراج البروتينات الغشاء في المرحلة القابلة للذوبان2. وبناء على ذلك، غير المنظفات الميكانيكية، واستنادا إلى أساليب تعطيل الخلية توفر نتائج أنظف. هناك عدة طرق لتعطل الخلايا نمت في الثقافة أو حصادها من الدم أو الأجهزة الميكانيكية. هذه تشمل دونس التجانس وتعطل غرامة إبرة وتجانس الحاملة للكرة، sonication والتجويف النيتروجين. هنا نقوم بتقييم التجويف النيتروجين وذلك مقارنة بالأساليب الأخرى. التجويف النيتروجين تعتمد على النيتروجين الذي يذوب في السيتوبلازم للخلايا تحت ضغط عال. تعليق خلية بعد الموازنة، فجأة تتعرض للضغط الجوي أن تتشكل فقاعات النيتروجين في السيتوبلازم التي تمزق فتح الخلية نتيجة على مقوماته. إذا كان الضغط مرتفع بما فيه الكفاية، مقوماته النيتروجين يمكن أن تعطل نواة3 والغشاء ملزمة العضيات مثل ليسوسوميس4. ومع ذلك، إذا كان يتم الاحتفاظ الضغوط منخفضة بما يكفي، سوف تعطيل تخفيف الضغط غشاء البلازما و ER ولكن لا العضيات الأخرى، وبالتالي إراقة سيتوسول والعضيات هيولى سليمة في هوموجيناتي الذي تم تعيينه كافيتاتي5. ولهذا السبب، التجويف النيتروجين هو الأسلوب المفضل لعزل العضيات مثل lysosomes والميتوكوندريا.
ومع ذلك، كما أنها وسيلة ممتازة لإعداد هوموجيناتي التي يمكن فصلها بسهولة في الغشاء وكسور قابلة للذوبان. وعاء الضغط (من الآن فصاعدا باسم “قنبلة”) المستخدمة خلال التجويف تتكون من غلاف سميك من الفولاذ المقاوم للصدأ الذي يقاوم الضغط العالي، مع مدخل لتسليم غاز النيتروجين من دبابة ومنفذ مخرج مع صمام تفريغ قابل لتعديل.
وقد استخدمت التجويف النيتروجين لتجانس الخلية منذ الستينات6. في عام 1961، أنشأ صياد وكوميرفولد7 التجويف النيتروجين كبديل ناجع لاضطراب أنسجة الثدييات. ومنذ ذلك الحين، الباحثين قد تكيفت هذه التقنية لمختلف الخلايا والأنسجة بنجاح، والتجويف النيتروجين قد أصبح عنصرا أساسيا في العديد من التطبيقات، بما في ذلك الغشاء إعداد8،9ونوي وعضيه إعداد10،11، واستخراج البيوكيميائية مجا. حاليا، علماء الأحياء الخلية أكثر في كثير من الأحيان يستخدمون أساليب أخرى لتجانس خلية لفوائد النيتروجين التجانس لا يعلن عنها على نطاق واسع، والقنابل النيتروجين غالية الثمن وهناك الاعتقاد خاطئ بأن عدد كبير نسبيا من الخلايا مطلوب. لم يتم نشر بروتوكولات التجويف النيتروجين لتحقيق هوموجيناتيس الخلية خالية مع نويات سليمة، وفي التقييمات الأكثر المنشورة كانت تستخدم وحدات تخزين 20 مل من تعليق خلية. للتكيف مع هذا الأسلوب الكلاسيكي لتتناسب مع الاحتياجات الحالية للعمل مع عينات صغيرة الحجم، نقدم على بروتوكول تعديل التجويف النيتروجين مصممة خصيصا للخلايا المستزرعة. بعد التجويف النيتروجين، هوموجيناتي تنقسم القابلة للذوبان (S) والكسور غشاء (P) بالطرد المركزي التفاضلي، أولاً مع تدور السرعة المنخفضة لإزالة الأنوية والخلايا غير منقطعة، ثم مع تدور عالية السرعة (> 100,000 x ز) لفصل أغشية من الكسر القابلة للذوبان. نقوم بتحليل كفاءة الفصل مع إيمونوبلوتس وقارن التجويف النيتروجين مع تقنيات التعطيل الميكانيكية الأخرى. ونحن أيضا التحقيق ناضح تأثير تجانس المخزن المؤقت خلال التجويف النيتروجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتتعدد مزايا التجويف النيتروجين عبر طرق أخرى لتعطيل الميكانيكية. ربما الفائدة الأكثر أهمية هو قدرته على تجانسه بلطف ولكن كفاءة العينات. المبادئ الفيزيائية للعينات يبرد الضغط بدلاً من توليد التدفئة المحلية الأضرار مثل الموجات فوق الصوتية والقص/الاحتكاك على أساس تقنيات. التجويف أيضا فعال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من GM055279 و CA116034 و CA163489.
Materials
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
References
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
