Cavitazione di azoto e centrifugazione differenziale permette di monitorare la distribuzione periferica delle proteine di membrana in cellule coltivate

Proteine cellulari possono essere suddivisi in due classi: quelli che sono associati con membrane e quelli che non sono. Proteine associate non-membrana si trovano nel citosol, nucleoplasma e lumina degli organelli come il reticolo endoplasmico (ER). Ci sono due classi di proteine di membrana-collegato, integrale e periferici. Proteine integrali di membrana sono noti anche come proteine transmembrana, poiché uno o più segmenti della catena del polipeptide si estende la membrana, in genere come un α-elica composta da amminoacidi idrofobici. Proteine transmembrana co-translationally vengono inseriti nelle membrane nel corso della loro biosintesi e rimangono così configurate fino a quando essi sono catabolizzate. Proteine di membrana periferico secondariamente sono spinti a membrane, solitamente come conseguenza di modificazione post-traduzionale con molecole idrofobe quali i lipidi. A differenza di proteine integrali di membrana, l’associazione di proteine di membrana periferico con le membrane cellulari è reversibile e può essere regolata. Molti funzione di proteine di membrana periferico in vie di segnalazione e regolamentato associazione con membrane è un meccanismo per attivando o inibendo una via. Un esempio di una molecola di segnalazione che è una proteina di membrana periferico è il piccolo GTPase, RAS. Dopo una serie di modificazioni post-traduzionali che includono la modifica con un lipido di farnesyl, modificate C-terminale di una proteina RAS matura inserisce l’opuscolo citoplasmatico della membrana cellulare. In particolare, la membrana plasmatica è dove il RAS si aggancia il suo effettore a valle RAF1. Per impedire l’attivazione costitutiva della chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK), livelli multipli di controllo RAS sono a posto. Oltre a rendering RAS inattivo idrolizzando il GTP in PIL, RAS attivo anche può essere rilasciato dalla membrana plasmatica da modifiche o interazioni con solubilizzanti fattori per inibire la segnalazione. Anche se fluorescente live imaging offre biologi cellulari l’opportunità di osservare la localizzazione subcellulare delle proteine di membrana periferico della proteina-etichetta fluorescente¹, ci rimane un bisogno fondamentale per valutare l’associazione della membrana di proteine endogene semi-quantitativamente con semplici approcci biochimici.

L’appropriata valutazione biochimica delle proteine partizionamento tra membrana e frazioni solubili è criticamente dipendono da due fattori: cellulare omogeneizzazione ed efficiente separazione della membrana e frazioni solubili. Anche se alcuni protocolli, tra cui i kit commercializzati più ampiamente usati, dipendono dall’omogeneizzazione di detergente a base di cellule, questi metodi possono offuscare analisi tramite l’estrazione di proteine di membrana nei solubile fase². Di conseguenza, non detergente basati, meccanici metodi di distruzione cellulare forniscono risultati più puliti. Ci sono diversi metodi di rottura meccanica delle cellule in coltura o raccolte dal sangue o organi. Questi includono lisata omogeneizzazione, rottura fine dell’ago, cuscinetti a sfera omogeneizzazione, sonicazione e cavitazione di azoto. Qui valutiamo cavitazione di azoto e confrontarlo con altri metodi. Cavitazione di azoto si basa sull’azoto che è dissolto nel citoplasma delle cellule ad alta pressione. Dopo l’equilibratura, la sospensione cellulare bruscamente è esposta alla pressione atmosferica tale che bolle di azoto si formano nel citoplasma che strappare aperto la cella in conseguenza del loro effervescenza. Se la pressione è sufficientemente elevata, effervescenza di azoto possa interferire con il nucleo³ e membrana associato organelli come i lisosomi⁴. Tuttavia, se la pressione è mantenuta abbastanza bassa, la decompressione altererà la membrana plasmatica ed ER ma non altri organelli, quindi versare sia cytosol e organelli citoplasmici intatti nell’omogenato viene designato il cavitate⁵. Per questo motivo, la cavitazione di azoto è il metodo di scelta per l’isolamento di organelli come i lisosomi e mitocondri.

Tuttavia, è anche un ottimo modo di preparare un omogeneato che può essere facilmente separato in membrana e frazioni solubili. Il recipiente a pressione (d’ora in poi chiamato “the bomb”) utilizzato durante la cavitazione è costituito da un involucro di acciaio inox spessore che resiste ad alta pressione, con un ingresso per la consegna del gas dell’azoto da un serbatoio e un orificio di presa con valvola di scarico regolabile.

Cavitazione di azoto è stato utilizzato per l’omogeneizzazione delle cellule dal 1960s⁶. Nel 1961, Hunter e Commerfold⁷ stabilito cavitazione di azoto come una valida opzione per distruzione di tessuti di mammiferi. Da allora, i ricercatori hanno adattato la tecnica di varie cellule e tessuti con successo e cavitazione azoto è diventato un fiocco in più applicazioni, tra cui membrana preparazione^8,9, nuclei e organello preparazione^10,11ed estrazione biochimici labili. Attualmente, i biologi delle cellule più spesso impiegano altri metodi di omogeneizzazione delle cellule perché i benefici di omogeneizzazione di azoto non sono stati ampiamente pubblicizzati, bombe di azoto sono costose e c’è un equivoco che un numero relativamente elevato di celle è Obbligatorio. Protocolli per la cavitazione di azoto raggiungere omogeneati privo di cellule con nuclei intatti non sono stati pubblicati, e nelle valutazioni pubblicati più volumi di 20 mL di sospensione cellulare sono stati usati. Per adattare questa tecnica classica per soddisfare i requisiti attuali di lavorare con campioni di piccole dimensioni, vi presentiamo un protocollo modificato di cavitazione di azoto specificamente progettato per le cellule coltivate. Dopo cavitazione di azoto, l’omogeneizzato è separato in solubili (S) e frazioni di membrana (P) tramite centrifugazione differenziale, prima con un giro di basso-velocità per rimuovere i nuclei e cellule ininterrotte e poi con una rotazione ad alta velocità (> 100.000 x g) per separare membrane dalla frazione solubile. Analizziamo l’efficienza della separazione con immunoblots e confrontare cavitazione di azoto con altre tecniche di rottura meccanica. Studiamo anche l’effetto osmotico del buffer di omogeneizzazione durante la cavitazione di azoto.