Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия
Summary
Мы представляем собой протокол для быстрого характеристика биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия с термолабильных лигандов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии.
Abstract
Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) – это мощный метод для количественной оценки термодинамических параметров, регулирующих биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия. Эта информация имеет решающее значение в разработке новых фармацевтических соединений. Однако многие фармацевтически соответствующих лигандов являются химически неустойчивыми при высоких температурах, используемых в ДСК анализов. Таким образом измерения привязки взаимодействия сложным, потому что концентраций лигандов и термически преобразованы продукции постоянно меняются в ячейке калориметра. Здесь мы представляем протокол, с помощью термолабильных лигандов и ДСК для быстрого получения термодинамические и кинетические информации о складывания, привязки и лигандом процессов преобразования. Мы применили метод к ДНК aptamer MN4, которая связывает термолабильных лигандом кокаина. С помощью новой глобальной установки анализа, который приходится термолабильных лигандом преобразования, полный набор складывания и привязки параметров получаются из пару DSC экспериментов. Кроме того мы показываем, что константа скорости термолабильных лигандом преобразования могут быть получены с только один дополнительный набор DSC. Представлены руководящие принципы выявления и анализа данных из нескольких более сложных сценариев, включая необратимой агрегации биомолекулы, медленно складывающиеся, медленно привязки, и быстрое истощение запасов термолабильных лиганда.
Introduction
Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)-это мощный метод для quantitating биомолекулярных привязки и складной взаимодействия1,2,3. Сильные ДСК включают способность для уточнения привязки и складные механизмы и давать соответствующие термодинамических параметров2,3. Кроме того DSC может быть выполнена в растворе рядом физиологических условиях и не требует маркировки биомолекулы или лиганд, например, с флуорофоров, спин этикетки или ядерные изотопы4. Инструмент сканирует температуры, измерять количество тепла, необходимое чтобы денатурировать биомолекулы в присутствии и отсутствии лиганда. Результате термограммы используются для извлечения термодинамических параметров, управляющих лигандом привязки и складывающиеся процессов. Информацию, представленную ДСК или других термодинамических методов имеет решающее значение для руководства дизайн наркотиков ориентации биомолекул1,5,6,,78. Однако повторное сканирование для высоких температур (~ 60-100 ° C) может быть проблематичным. Например многие фармацевтически важных соединений проходят перегруппировки или разложение после устойчивого воздействия высокой температуры9,10,11, т.е., они термолабильных. Экспертиза привязки взаимодействия, DSC, обычно требует несколько вперед и обратного сканирования для проверки воспроизводимости термограммы термодинамический анализ12. Термический первоначального лигандом для вторичной формой с характеристиками измененной привязки приводит к заметными различиями в форму и положение последовательных термограммы, так как концентрация первоначального лигандом уменьшается с каждой проверки во время Термический продуктов накапливаются. Эти наборы данных не поддаются традиционным анализом.
Мы недавно разработали метод глобальные установки для термолабильных лигандом DSC наборов данных, что дает полный набор термодинамических параметров регулирующих биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия от одного лиганд прыгните эксперимент, связанный с требуемой термограммы для свободного биомолекулы4. Анализ уменьшает время экспериментальных и образец требует ~ 10 раз по сравнению с стандартным DSC подходов. Мы составили для лигандом термический, предполагая, что это происходит во время высокой температуры часть каждого сканирования, где термограммы не зависит от концентрации лиганда. Таким образом концентрация лиганд — константа, в части термограммы, который используется для извлечения термодинамических параметров. Дополнительно мы продемонстрировали, как константа скорости лигандом термический можно получить, выполнив один дополнительный эксперимент с более длительный период уравновешивания высокой температуры. Для систем, где лигандом термический менее зависит от температуры (т.е., в значительной степени происходит при всех температурах), анализ может быть изменен для включения переменной лигандом концентрации. Здесь мы показываем эту процедуру для ДНК aptamer MN4 присутствии термолабильных лигандом кокаина, который быстро преобразует бензилэкгоин при высоких температурах (> 60 ° C). Хинин используется как отрицательный контроль для лигандом thermolability, поскольку она не претерпела преобразования при этих температурах экспериментально и также связывает MN4. Мы описываем приобретение термолабильных лигандом DSC наборов данных и их анализа, уступая термодинамические и кинетические параметры складывания, привязки и лигандом процессов преобразования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модификации и устранение неполадок
Данные анализа глобальной установки, используемых в Рисунок 1 и 2 были описаны ранее4. Здесь мы приводим практические аспекты выполнения и анализа ДСК привязки эксперименты с термол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R. W. H. V был поддержан МакГилл естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) программа обучения в Bionanomachines. А. к. м. и P. E. J. были поддержаны Сенти грантов 327028-09 (A. K. М) и 238562 (P. E. J.).
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
