قياس الملامح الجزيئية البيولوجية DSC مع يغاندس ثيرمولابيلي لوصف سرعة قابلة للطي والربط التفاعلات
Summary
نقدم بروتوكول لتوصيف الجزيئية البيولوجية قابلة للطي وملزمة التفاعلات مع يغاندس ثيرمولابيلي باستخدام القياس فرق المسح السريع.
Abstract
فرق المسح القياس (DSC) تقنية قوية للتحديد الكمي لمعلمات دينامي حراري تحكم الجزيئية البيولوجية قابلة للطي والتفاعلات ملزمة. تعتبر هذه المعلومات الحاسمة في تصميم المركبات الدوائية الجديدة. ومع ذلك، العديد من يغاندس فارماسيوتيكالي ذات الصلة غير مستقرة كيميائيا عند درجات الحرارة العالية المستخدمة في التحليلات DSC. وهكذا، قياس التفاعلات ملزم هو التحدي لأن تركيزات يغاندس وتحويلها حرارياً المنتجات المتغيرة باستمرار داخل الخلية مسعر. وهنا، يقدم بروتوكول باستخدام يغاندس ثيرمولابيلي و DSC لسرعة الحصول على المعلومات الحرارية والحركية على الطي والربط، ويجند عمليات التحويل. لقد قدمنا طلبا لدينا طريقة للحمض النووي ابتمر MN4 الذي يربط بين الكوكايين يجند ثيرمولابيلي. استخدام تحليل تركيب عالمية جديدة التي تستأثر بتحويل يجند ثيرمولابيلي، يتم الحصول على مجموعة كاملة من طي ومعلمات الربط من زوج من تجارب DSC. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن يمكن الحصول على معدل ثابت للتحويل يجند ثيرمولابيلي مع واحد فقط dataset DSC التكميلية. وترد المبادئ التوجيهية لتحديد وتحليل البيانات من عدة سيناريوهات أكثر تعقيداً، بما في ذلك تجميع بيوموليكولي وطي بطيئة، بطيئة ملزمة والاستنفاد السريع ليجند ثيرمولابيلي لا رجعة فيه.
Introduction
فرق المسح القياس (DSC) وسيلة قوية كوانتيتاتينج الجزيئية البيولوجية ملزمة وقابلة للطي التفاعلات1،،من23. وتشمل مواطن قوة DSC قدرتها على توضيح ملزمة وقابلة للطي آليات، وأن تسفر عن2،معلمات دينامي حراري المقابلة3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤديها في حل الظروف الفسيولوجية قرب DSC ولا تشترط وسم بيوموليكولي أو يجند، مثلاً، مع فلوروفوريس، وتدور التسميات أو النظائر النووية4. يمسح الصك في درجة الحرارة، وقياس كمية الحرارة المطلوبة لتجريدها في بيوموليكولي في وجود وغياب ليجند. ثيرموجرامس الناتجة عن ذلك تستخدم لاستخراج معلمات دينامي حراري يجند ملزمة وقابلة للطي عمليات الإدارة. المعلومات المقدمة من DSC أو غيرها من التقنيات الحرارية ضروري لتوجيه تصميم المخدرات تستهدف الجزيئات الحيوية1،،من56،،من78. ومع ذلك، المسح المتكرر لدرجات حرارة عالية (~ 60-100 درجة مئوية) يمكن أن يكون مشكلة. على سبيل المثال، العديد من المركبات الهامة فارماسيوتيكالي الخضوع لإعادة ترتيب أو التحلل عند التعرض المستمر لدرجات الحرارة المرتفعة9،،من1011، أي، ثيرمولابيلي. يتطلب دراسة ملزمة التفاعلات التي DSC عادة متعددة إلى الأمام وعكس الأشعة بغية التحقق من إمكانية تكرار نتائج للشخصية لتحليل دينامي حراري12. تحويل الحرارية يجند الأولية إلى نموذج ثانوية مع خصائص ربط تغيير يؤدي إلى الفروق وضوحاً في الشكل والموقف من ثيرموجرامس المتعاقبة، نظراً لتركيز يجند الأولية تتناقص مع كل عملية مسح في حين منتجات التحويل الحراري تتراكم. مجموعات البيانات هذه غير قابلة للتحليل التقليدي.
مؤخرا قمنا بتطوير أسلوب عالمي مناسب ليجند ثيرمولابيلي DSC مجموعات البيانات التي تعطي مجموعة كاملة من معلمات دينامي حراري الإدارة الجزيئية البيولوجية قابلة للطي وملزمة التفاعلات من تجربة واحدة يجند زمنياً المشار إليها إلى الشخصية المطلوبة ل بيوموليكولي الحرة4. التحليل يقلل الوقت التجريبي والعينة التي تتطلبها ~ 10 إضعاف بالمقارنة مع نهج DSC قياسية. ونحن قد شكلت ليجند التحويل الحراري بافتراض هذا يحدث أثناء الجزء درجة حرارة عالية لمسح كل حيث الشخصية لا تعتمد على تركيز يجند. ولذلك، يتم تركيز يجند ثابت داخل جزء الشخصية التي تستخدم لاستخراج معلمات دينامي حراري. بالإضافة إلى ذلك أظهرنا كيف يمكن الحصول على معدل ثابت ليجند التحويل الحراري عن طريق إجراء تجربة تكميلية واحدة مع فترة الموازنة أطول في درجة حرارة عالية. لأنظمة التحويل الحراري يجند فيها تعتمد على درجة حرارة أقل (أيحدوث ملحوظ في جميع درجات الحرارة)، التحليل ويمكن تعديلها لتشمل تركيزات يجند متغير. هنا نظهر هذا الإجراء للحمض النووي ابتمر MN4 حضور الكوكايين يجند ثيرمولابيلي، الذي تحول سريعاً إلى بينزويليكجونيني في درجات حرارة عالية (> 60 درجة مئوية). يتم استخدام الكينين كعنصر تحكم سلبية ليجند ثيرمولابيليتي نظراً لأنها لا تخضع للتحويل في هذه درجات الحرارة التجريبية، وأيضا بربط MN4. يصف لنا اقتناء يجند ثيرمولابيلي DSC مجموعات البيانات وتحليلها مما أسفر عن معلمات دينامي حراري والحركية للطي والربط، ويجند عمليات التحويل.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
تفاصيل التحليل المناسب العالمية المستخدمة في الشكل 1 و الشكل 2 تم وصف سابقا4. هنا، فإننا مخطط الجوانب العملية لتنفيذ وتحليل تجارب DSC ملزمة مع يغاندس ثيرمولابيلي. ملاحظة الحصول على خط ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ر. دبليو حاء الخامس أيده ماكغيل العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) البرنامج التدريبي في بيونانوماتشينيس. أ. م. ك. وب. أ. ج. كانت تدعمها في منح الأموال 327028-09 (أ. ك. م) و 238562 (ب. أ. ج.).
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
