Mesurer les profils biomoléculaire DSC avec des Ligands Thermolabile de caractériser rapidement pliage et reliure Interactions

Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une méthode puissante pour quantifiant liaison biomoléculaire et pliage des interactions^1,2,3. Les points forts de DSC incluent sa capacité d’élucider contraignant et pliage des mécanismes et à céder les paramètres thermodynamiques correspondantes^2,3. En outre, DSC peut être effectuée en solution dans des conditions physiologiques près et ne nécessite pas de marquage de la biomolécule ou ligands, par exemple, avec des fluorophores, spin-étiquettes ou isotopes nucléaires⁴. L’instrument balaye de température, mesure de la quantité de chaleur nécessaire pour dénaturer la biomolécule en présence et en absence de ligand. Les thermogrammes qui en résultent sont utilisées pour extraire les paramètres thermodynamiques qui régissent le ligand binding et processus de pliage. Les informations fournies par DSC ou d’autres techniques thermodynamiques sont essentielles pour guider la conception des médicaments ciblant des biomolécules^1,5,6,7,8. Cependant, l’analyse répétée à des températures élevées (~ 60-100 ° C) peut s’avérer problématique. Par exemple, de nombreux composés pharmaceutiquement importants subissent une transposition ou décomposition après exposition à des températures élevées^9,10,11, c’est-à-dire, ils sont thermolabiles. Examen de liaison généralement les interactions par DSC exige des scans multiples avant et arrière afin de vérifier la reproductibilité de la thermogramme pour analyses thermodynamiques¹². Conversion thermique d’un ligand initiale à une forme secondaire présentant des caractéristiques de liaison modifiée entraîne des différences marquées dans la forme et la position des thermogrammes successifs, car la concentration de ligand initial diminue avec chaque scan tout en le produits de conversion thermique s’accumulent. Ces ensembles de données ne se prêtent pas aux analyses traditionnelles.

Nous avons récemment mis au point une méthode de lissage global datasets thermolabile ligand DSC qui cède l’ensemble complet des paramètres thermodynamiques qui régissent le pliage biomoléculaire et contraignant les interactions d’une seule expérience de ligand lié cité la thermogramme requise pour la biomolécule gratuit⁴. L’analyse réduit le temps expérimental et les échantillons requis par ~ 10 fois par rapport aux approches DSC standard. Nous avons représenté pour ligand conversion thermique en supposant que cela se passe pendant la phase de haute température de chaque balayage où le thermogramme ne dépend pas de la concentration de ligand. Par conséquent, la concentration de ligand est une constante dans la portion de la thermogramme qui est utilisé pour extraire des paramètres thermodynamiques. En outre, nous avons démontré comment la constante de vitesse pour la conversion thermique ligand peut être obtenue en effectuant une expérience supplémentaire avec une plus longue période d’équilibration de haute température. Pour les systèmes où la conversion thermique de ligand est moins dépendante de la température (c’est-à-diresurvenant de façon appréciable à toutes les températures), l’analyse peut être modifiée pour inclure des concentrations variables de ligand. Nous démontrons cette procédure pour l’ADN aptamère MN4 en présence de la cocaïne de ligand thermolabile, qui se transforme rapidement en benzoylecgonine à des températures élevées (> 60 ° C). La quinine est utilisée comme contrôle négatif pour la thermolabilité de ligand puisqu’il ne subit pas de conversion à ces températures expérimentales et lie également à MN4. Nous décrivons l’acquisition de ligand thermolabile DSC datasets et leur analyse, ce qui donne des paramètres thermodynamiques et cinétiques de la plier, une liaison et ligand des processus de conversion.