Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda
Summary
Grip A virüs (IAVs) önemli insan solunum patojenler vardır. İnsan fizyolojisi taklit hayvan modelleri IAVs patojenitesi anlamak ve preklinik roman aşı yaklaşımlar sınamasını gerçekleştirmek için gereklidir. Burada, biz IAV Patogenez, humoral yanıt ve enfeksiyon bir fare modeli kullanarak aşı etkinliğini değerlendirmek için teknikler açıklanmaktadır.
Abstract
Grip virüsleri 500.000 ölüm dünya çapında1 neden ve 12-14 milyar USD Amerika Birleşik Devletleri tek başına doğrudan tıbbi ve hastaneye yatış masrafları ve iş devamsızlık2göz önünde bulundurarak bir yıllık ücret ile ilişkilidir. Hayvan modelleri viral Patogenez, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri, bağışıklık yanıtı değerlendirmek için grip A virüs (IAV) çalışmalarda açısından büyük önem taşıyor ve antiviral yanı sıra geçerli ve/veya roman aşı etkinliği yaklaşıyor. Bağışıklık sistemi örümceklerle insanlarda bulunan benzer çünkü fareler bir avantajlı küçük hayvan modeli değildir, onlar are elde edilebilir–dan genetik olarak aynı konular olarak ticari satıcı, değerlendirmek için istismar birden fazla suşları vardır enfeksiyonlar, genetik temeli ve onlar are oranla ucuz ve kolay işlemek. Solunum yolları üzerinden insanlarda IAV enfeksiyon özetlemek için fareler ilk uygun Biyogüvenlik koruma altında bulaşıcı IAVs ile burunici aşılama öncesinde anestezi. Enfeksiyon sonra IAVs patogenezinde günlük (vücut kilo kaybı) morbidite ve mortalite (hayatta kalma) izleme tarafından belirlenir. Buna ek olarak, viral Patogenez Ayrıca virüs çoğaltma üst (nazal Mukoza) veya daha düşük (akciğerler) solunum yolu virüslü fareleri değerlendirmek tarafından değerlendirilebilir. Humoral yanıt üzerine IAV enfeksiyon hızla non-invaziv kanama veya değerlendirmeye ikincil antikor algılama tarafından deneyleri yönelik toplam varlığı tespit veya antikorları nötralize. Burada, fareler intranasally bulaştırmak için kullanılan ortak yöntemleri (ın) IAV ile açıklamak ve Patogenez, humoral bağışıklık yanıtı ve koruma etkinliği değerlendirin.
Introduction
IAVs Orthomyxoviridae aile3‘ te gizli saran virüsler vardır. Onlar sekiz tek iplikçikli RNA molekülleri ile negatif polarite3içerir. Roman virüslerden insan nüfusunun4‘ te tanıttığında insanlarda, mevsimlik salgın hastalıklar ve ara sıra salgınları önemli sonucu IAVs neden. Ayrıca, mevsimlik IAVs yükseltilmiş bir ekonomik kayıp dünya çapında her yıl2,5üreten insanlar arasında son derece ve hızla iletilir. Öksürük, burun tıkanıklığı, ateş, kırgınlık, baş ağrısı, iştahsızlık ve miyalji IAV belirtileri içerir, ancak virüs daha ağır bir hastalık immün hastalar6‘ da oluşturabilir. Aslında, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) mevsimsel grip virüsleri 300.000 500.000 ölüm dünya çapında her yıl1neden hesaplar. Şu anda gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından grip profilaksi ve insanlarda tedavisi için onaylanan ilaçların sadece iki sınıf vardır: neuraminidase (NA) inhibitörleri (örneğin, oseltamivir) ve blokerleri M2 iyon kanalının (örn., Amantadin); Ancak, ilaca dirençli virüs türevleri ortaya çıkması artan bir konusudur. Aşı, bu nedenle, insanlar IAVs enfeksiyonlarına karşı korumak için en iyi tıbbi seçenek kalır. Bugüne kadar grip üç tür insan kullanmak için FDA tarafından lisanslı aşı mevcuttur: inaktive rekombinant viral hemagglutinin (HA) protein aşılar grip aşıları (IIV) ve canlı zayıflatılmış grip aşıları (LAIV)5, 7. üç aşılar viral HA protein IAVs karşı antikor nötralize uğrak karşı adaptif immün yanıt ikna etmek için tasarlanmıştır.
IAV enfeksiyon vivo içinde çalışmaya doğrulanmış fare modeli
Hayvan modelleri, diğerleri arasında IAV Patogenez8,9,10,11, hastalık12 ve/veya viral iletim13 katkıda viral etkenler çalışma için kullanılan ,14, ve9,10,15yeni aşılar veya antiviral etkinliğini test etmek için ilaç. Fareler (Mus musculus) en yaygın kullanılan hayvan modeli IAV araştırma için birkaç nedeni vardır: 1) bağışıklık sisteminin evrimsel benzer bu mevcut insanlarda; 2) düşük maliyetli, dahil olmak üzere hayvan satın, konut ve üreme; 3) kolayca işlemek ve saklamak için küçük boyutu; 4) en az ana bilgisayar değişkenlik homojen yanıt ve sonuçları elde etmek için; 5) fareler biyoloji, genom sırası da dahil olmak üzere büyük bir bilgi; 6) birçok kullanılabilir moleküler biyoloji ve/veya İmmünoloji reaktifler; 7) viral enfeksiyon bir konağın protein katkısını çalışmaya (KO) fareler dışarı mevcut knock; ve 8) enfeksiyonları genetik temeli değerlendirmek için istismar birden çok fare suşları.
Orada birkaç fare suşları IAV vivo içindeincelemek için şu anda kullanılabilecek. Yaş, bağışıklık durumu, cinsiyet, genetik arka plan ve fare zorlanma yanı sıra yolları enfeksiyonu, doz ve viral suşları farelerde IAV enfeksiyon sonucu etkiler. Onlar iki eski suşları16,17,18yaşından, IAV hastalıklara daha duyarlı olduğundan IAV araştırmalarında kullanılan en yaygın fare suşları C57BL/6, BALB/C ve daha yakın zamanlarda, DBA.2 fareler vardır 19 , 20. önemlisi bağışıklık yanıtı da bağlı olarak fare zorlanma18,19,20farklı olabilir. Böylece, fare ve yapılacak deney için en iyi seçenek seçmek için IAV zorlanma ilişkin tüm bilgiler kurtarmak çok önemlidir.
Fare için in vivo çalışmalar IAV ile enfeksiyon iyi bir hayvan model olsa da, onlar deneysel tasarımında dikkat edilmesi gereken bazı sınırlamaları var. Örneğin, in vivo çalışmalar için fare kullanarak büyük bir sınırlama IAVs fareler arasında iletmek değil olduğunu. Böylece, aktarım için çalışmalar, daha kabul hayvan modelleri (örneğin, yaban gelinciği veya eskiden şiling şimdi pigs) kullanılan16,17,21. Buna ek olarak, farelerde IAV tezahürleri ve insanlar arasında çeşitli farklar vardır. İnsanlar farklı olarak, fare ateş IAV enfeksiyon üzerine geliştirmek mi; diğer taraftan hipotermi16,17ile mevcut. Farelerde, alt solunum yolu (akciğerler) üst solunum yolları yerine IAV çoğaltma yoğunlaşmıştır. Böylece, IAV virülans farelerde her zaman için insanlarda görülen correlated değil. Özet olarak, sınırlı dezavantajları avantajları ağır bastığı için fare grip viral Patogenez, immünojenisite ve aşı ve antiviral çalışmalarda koruyucu etkinliği değerlendirmek için kullanılan ilk hayvan modeli temsil eder. Ayrıca, bu IAV enfeksiyon bir küçük hayvan modelinde önceki kanıt olmadan büyük hayvan modeller kullanarak IAV ile çalışmalar yapmak için etik açıdan kabul edilebilir değil. Bu makale, biz fareler intranasally bulaştırmak anlatan (i.n.) IAV, önem derecesi ve viral enfeksiyon ilerlemesini izlemek nasıl ve nasıl humoral bağışıklık yanıtı ve koruma etkinliğini değerlendirmek için gerekli deneyler yürütmek için.
Protocol
Representative Results
Discussion
IAV fare modeli IAV Patogenez, immünojenisite ve koruma etkinliğinin in vivo çalışmalar için yaygın olarak kullanılır. Fareler küçük boyutunu değiştirmek ve yaban gelinciği veya eskiden şiling şimdi pigs gibi hayvan diğer modeller ile karşılaştırıldığında depolamak kolaylaştırır. Ayrıca, kolaylığı açısından maliyet hayvan konut ve üreme hayvanlar çok sayıda gerekli önceden klinik aşı testlerinde kullanımlarını sağlar. Özellikle, beri fareler içinde kullanılan bird…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grip virüsü LM-S laboratuvarında araştırma kısmen New York grip Center of Excellence (NYICE), NIAID merkezleri grip araştırma ve gözetleme (CEIRS) için mükemmel bir üyesi tarafından finanse edilmektedir. Biz Wendy Bates el yazması düzeltmeler onun desteği için teşekkür ederim.
Materials
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice | National Cancer Institute (NCI) | 01XBE | |
| Turckey red blod cells | Biolink Inc | Store at 4°C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4°C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100X | Corning | 30-009-CI | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100X | Corning | 30-00-CI | Store at -20°C |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4°C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4°C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20°C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATTC | H16-L10-4R5 | Store at -20°C |
| Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC | Dako | F0261 | Store at 4°C |
| ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody | GE Healthcare | LNA931V/AG | Store at 4°C |
| TMB substrate set | BioLegend | 421101 | Store at 4°C |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices | ||
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Receptor destroying enzyme, RDE (II) | Denka Seiken Co. | 370013 | Store at -20°C |
| Crystal Violet | Fisher Scienctific | C581-100 | Store at RT |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scienctific | 269620 | |
| Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates | Thermo Fisher Scienctific | 249570 | |
| Puralub Vet Ointment | Dechra | 9N-76855 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | Olympus IX81 |
References
- Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
- Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, 255-264 (2000).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. , (2007).
- Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
- Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
- Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
- Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
- Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
- Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
- Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
- Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
- Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
- Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
- Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
- Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
- Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
- Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857 (2009).
- Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
- Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
- Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
- National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
- Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
- Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
- Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
- He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
- Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
- Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
- Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
- Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).
