Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection
Summary
Virus de l’influenza (IAVs) sont des agents pathogènes respiratoires humains importants. Pour comprendre le pouvoir pathogène de IAVs et d’effectuer des essais précliniques de nouveau vaccin approches, modèles animaux imitant la physiologie humaine sont nécessaires. Nous décrivons ici les techniques pour évaluer l’IAV pathogenèse, humorale et l’efficacité du vaccin en utilisant un modèle de souris de l’infection.
Abstract
Virus de la grippe provoquent plus de 500 000 décès dans le monde1 et sont associées à un coût annuel de 12 milliards USD aux États-Unis seul examen direct medical et frais d’hospitalisation et de l’absentéisme de travail2. Modèles animaux sont cruciaux pour l’Influenza A virus (IAV) études visant à évaluer la pathogénèse virale, les interactions hôte-pathogène, les réponses immunitaires, et l’efficacité du vaccin actuel et/ou nouvel approches ainsi que des antiviraux. Les souris sont un modèle animal petit avantageux parce que leur système immunitaire est évolutivement semblable à celle trouvée chez les humains, ils sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux comme des sujets génétiquement identiques, il existe plusieurs souches qui peuvent être exploitées pour évaluer la base génétique des infections, et ils sont relativement peu coûteux et facile à manipuler. Pour récapituler infection IAV chez l’homme via les voies respiratoires, les souris sont tout d’abord anesthésiés avant l’inoculation intranasale avec IAVs infectieuses sous confinement de biosécurité appropriées. Après l’infection, la pathogenèse de l’IAV est déterminée en surveillant quotidiennement la morbidité (perte de poids corporel) et le taux de mortalité (survie). En outre, Pathogénèse virale peut aussi être évaluée en évaluant la réplication du virus dans les voies respiratoires inférieures des (poumons) de souris infectées ou supérieur (muqueuse nasale). Les réponses humorales infectées de l’IAV peuvent être rapidement évaluées par saignement non invasif et la détection de l’anticorps secondaire essais visant à détecter la présence de total ou de présence d’anticorps neutralisants. Nous décrivons ici les méthodes couramment employées pour infecter des souris par voie intranasale (i.n) avec l’IAV et évaluer la pathogenèse, immunité humorale et l’efficacité de la protection.
Introduction
IAVs sont des virus enveloppés, classés dans la famille Orthomyxoviridae 3. Ils contiennent huit molécules d’ARN simple brin à polarité négative3. Chez l’homme, IAVs causent des épidémies saisonnières et occasionnelles pandémies de conséquence importante lorsque de nouveaux virus sont introduits dans la population humaine4. En outre, les IAVs saisonniers sont fortement et rapidement transmis entre humains produisant une perte économique élevée dans le monde entier chaque année2,5. IAV symptômes toux, congestion nasale, fièvre, malaise, céphalées, anorexie et myalgie, mais le virus peut également produire une maladie plus grave chez les patients immunodéprimés,6. En fait, l’Organisation mondiale de la santé (OMS) calcule que les virus grippaux saisonniers causent 300 000-500 000 décès dans le monde chaque année1. Il y a que deux classes de médicaments actuellement approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) pour la prophylaxie de la grippe et le traitement chez l’homme : inhibiteurs de la neuraminidase (NA) (p. ex., l’oseltamivir) et les inhibiteurs du canal ionique M2 (p. ex., amantadine) ; Cependant, l’apparition de variantes de virus résistants aux médicaments est une préoccupation croissante. Vaccination, reste donc la meilleure option médicale pour protéger les humains contre les infections de l’IAV. À ce jour, trois types d’influenza vaccins autorisés par la FDA pour l’usage humain sont disponibles : vaccins de protéines de recombinaison virale hémagglutinine (HA), inactivés (IIV) vaccins contre la grippe et grippe vivant atténué vaccins (LAIV)5, 7. les trois vaccins sont conçus pour induire une réponse immunitaire adaptative contre la protéine virale de HA, la cible majeure de neutraliser les anticorps dirigés contre les IAVs.
Un modèle de souris validés pour étudier IAV infection in vivo
Des modèles animaux ont été utilisés pour étudier, entre autres, IAV pathogenèse8,9,10,11, virales facteurs favorisant la maladie12 et/ou de la transmission virale13 ,14, et pour tester l’efficacité des nouveaux vaccins ou antiviral drugs9,10,15. Souris (Mus musculus) sont le plus largement utilisé modèle animal pour la recherche de l’IAV pour plusieurs raisons : 1) le système immunitaire est évolutif similaire à qui présenter chez les humains ; 2) achat animaux de faible coût, y compris, le logement et la reproduction ; 3) petite taille de facilement manipuler et stocker ; 4) variabilité d’hôte minimale pour obtenir des réponses homogènes et résultats ; 5) une grande connaissance de la biologie de souris, y compris la séquence du génome ; 6) nombreux disponible biologie moléculaire et/ou réactifs d’immunologie ; 7) disponible knock out (KO) de souris pour étudier la contribution d’une protéine de l’hôte donné sur l’infection virale ; et, 8) plusieurs souches de souris qui peuvent être exploitées pour évaluer la base génétique des infections.
Il y a plusieurs souches de souris actuellement disponibles pour étudier IAV in vivo. Âge, statut immunitaire, sexe, souche génétique de fond et de la souris ainsi que voies d’infection, de dose et de souches virales tous influencent le résultat de l’infection IAV chez la souris. Les souches de souris plus courants utilisés dans la recherche de l’IAV sont C57BL/6, BALB/C et, plus récemment, DBA.2 souris car ils sont plus sensibles aux maladies de l’IAV que les deux souches ancien16,17,18, 19 , 20. ce qui est important, la réponse immunitaire peut également être différente selon les souris souche18,19,20. Ainsi, il est très important de récupérer toutes les informations disponibles sur la souris et la souche de l’IAV à choisir la meilleure option pour l’expérience d’être menée.
Bien que la souris est un bon modèle animal de l’infection pour des études in vivo avec IAV, ils présentent plusieurs limites, dont il faut tenir compte dans la conception expérimentale. Par exemple, une limitation majeure de l’utilisation de souris pour les études in vivo est que les IAVs ne transmettent pas chez les souris. Ainsi, pour la transmission des études, mieux accepté des modèles animaux (p. ex., furets ou cochons d’Inde) sont utilisés16,17,21. En outre, il y a plusieurs différences entre les manifestations de l’IAV chez les souris et les humains. Contrairement aux êtres humains, la souris ne développent pas fièvre après infection IAV ; en revanche, ils présentent avec hypothermie16,17. Chez les souris, réplication de l’IAV est concentrée dans les voies respiratoires inférieures (poumons) plutôt que les voies aériennes supérieures. Ainsi, virulence de IAV chez la souris n’est pas toujours corrélé à celui observé chez les humains. Au total, parce que les avantages l’emportent sur les inconvénients limitées, souris représente le premier modèle animal utilisé pour évaluer l’efficacité protectrice dans les études de vaccins et d’antiviraux, l’immunogénicité et la pathogénèse virale de la grippe. En outre, il ne serait pas éthiquement acceptable de mener des études avec l’IAV à l’aide de grands modèles animaux sans preuve précédente dans un petit modèle animal de l’infection de l’IAV. Dans ce manuscrit, nous décrivons comment infecter des souris par voie intranasale (i.n.) avec IAV, comment surveiller la sévérité et la progression de l’infection virale et comment réaliser les expériences nécessaires pour évaluer l’efficacité de protection et de l’immunité humorale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle de souris de l’IAV est employé couramment pour des études in vivo d’efficacité de protection, l’immunogénicité et la pathogenèse IAV. La petite taille des souris le rend facile à manipuler et à stocker par rapport à d’autres modèles animaux comme furet ou cochon d’Inde. En outre, la facilité en ce qui concerne les animaux coûtent, logement et reproduction permettent leur utilisation dans des essais précliniques de vaccination où un grand nombre d’animaux est nécessaires. Not…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche sur le virus de la grippe en laboratoire LM-S est partiellement financée par The New York Influenza Center of Excellence (NYICE), un membre des centres d’Excellence en recherche sur l’Influenza et de Surveillance (CEIRS) NIAID. Nous remercions Wendy Bates pour son soutien dans les corrections du manuscrit.
Materials
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice | National Cancer Institute (NCI) | 01XBE | |
| Turckey red blod cells | Biolink Inc | Store at 4°C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4°C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100X | Corning | 30-009-CI | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100X | Corning | 30-00-CI | Store at -20°C |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4°C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4°C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20°C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATTC | H16-L10-4R5 | Store at -20°C |
| Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC | Dako | F0261 | Store at 4°C |
| ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody | GE Healthcare | LNA931V/AG | Store at 4°C |
| TMB substrate set | BioLegend | 421101 | Store at 4°C |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices | ||
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Receptor destroying enzyme, RDE (II) | Denka Seiken Co. | 370013 | Store at -20°C |
| Crystal Violet | Fisher Scienctific | C581-100 | Store at RT |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scienctific | 269620 | |
| Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates | Thermo Fisher Scienctific | 249570 | |
| Puralub Vet Ointment | Dechra | 9N-76855 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | Olympus IX81 |
References
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