فيروس الإنفلونزا أ الفيروس دراسات في نموذج ماوس للإصابة
Summary
فيروسات الإنفلونزا A (IAVs) هي العوامل الممرضة التنفسية البشرية الهامة. لفهم الحالة المرضية التي تحدثها IAVs وإجراء الاختبار السريري نهج لقاح الرواية، نماذج حيوانية تقليد الفسيولوجيا البشرية مطلوبة. هنا، نحن وصف تقنيات تقييم IAV المرضية واستجابات خلطيه وفعالية اللقاحات باستخدام نموذج الفأر من العدوى.
Abstract
فيروسات الإنفلونزا تتسبب في وفاة ما يزيد على 500,000 في العالم1 ، وترتبط بتكلفة سنوية تبلغ 12 بیلیون دولار في الولايات المتحدة وحدها النظر الطبية المباشرة، ونفقات العلاج في المستشفيات و التغيب عن العمل2. نماذج حيوانية تشكل عاملاً حاسما في فيروس الإنفلونزا أ الفيروس (عياف) دراسات لتقييم المرضية الفيروسية، والتفاعلات المضيف الممرض، والاستجابات المناعية، وفعالية اللقاحات الحالية و/أو رواية نهج فضلا عن الأدوية المضادة للفيروسات. الفئران نموذج حيوانات صغيرة مفيدة لأن نظامهم المناعي تقحم مشابهة لتلك الموجودة في البشر، فمتوفرة من البائعين التجاريين كمواضيع متطابقة وراثيا، وهناك سلالات متعددة يمكن استغلالها لتقييم الأساس الوراثي للإصابة، وغير مكلفة نسبيا وسهلة للتلاعب. أن الخص عياف الإصابة في البشر عبر الخطوط الجوية، أولاً يتم تخديره الفئران قبل التلقيح داخل الآنف مع IAVs المعدية تحت الاحتواء السلامة الأحيائية السليمة. بعد الإصابة، تتحدد الآلية المرضية ل IAVs الرصد اليومي الاعتلال (فقدان وزن الجسم) ومعدل الوفيات (البقاء على قيد الحياة). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تقييم المرضية الفيروسية بتقييم النسخ المتماثل الفيروس في الأعلى (الغشاء المخاطي للأنف) أو الجهاز التنفسي (الرئتين) أقل من الفئران المصابة. يمكن تقييم استجابات خلطيه عند الإصابة عياف سريعاً بالنزيف غير الغازية وكشف الأجسام المضادة الثانوية فحوصات تهدف إلى الكشف عن وجود مجموعة أو تحييد الأجسام المضادة. وهنا، يمكننا وصف الطرق الشائعة المستخدمة لتصيب الفئران إينتراناسالي (i.n) مع عياف وتقيم المرضية، والاستجابات المناعية خلطيه وفعالية الحماية.
Introduction
IAVs هي الفيروسات المغلفة مصنفة في أسرة اورثوميكسوفيريداى 3. أنها تحتوي على ثمانية جزيئات الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل مع الأقطاب السالبة3. في البشر، وتسبب IAVs الأوبئة الموسمية والأوبئة العرضية تترتب عليها آثار هامة عندما يتم إدخال فيروسات جديدة في عدد السكان4. وعلاوة على ذلك، IAVs الموسمية العالية وسرعة تنتقل بين البشر تنتج خسارة اقتصادية مرتفعة في جميع أنحاء العالم كل سنة2،5. وتشمل الأعراض عياف السعال، احتقان الآنف، الحمى والشعور بالضيق، والصداع، وفقدان الشهية وألم عضلي، ولكن الفيروس يمكن أن تنتج أيضا مرض أكثر شدة في مرضى المناعة6. في الواقع، أن منظمة الصحة العالمية (WHO) يحسب أن فيروسات الإنفلونزا الموسمية تتسبب في 300,000-500,000 حالة وفاة في العالم كل سنة1. وهناك فقط فئتين من الأدوية المعتمدة حاليا للأغذية والدواء (FDA) للوقاية من الإنفلونزا ومعاملة البشر: مثبطات النورامينيداز (غ) (مثلاً، الأوسيلتاميفير) وسد القناة أيون M2 (مثلاً، أمانتادين)؛ ومع ذلك، ظهور متغيرات الفيروس المقاوم للأدوية تثير قلقا متزايداً. ولذلك، يظل التطعيم، خيار طبية أفضل لحماية البشر ضد الإصابات IAVs. وحتى الآن، ثلاثة أنواع من الإنفلونزا تتوفر لقاحات مرخصة من قبل إدارة الأغذية والعقاقير للاستخدام البشري: اللقاحات البروتين المؤتلف الفيروسية هيماغلوتينين (ها)، إبطال لقاحات الإنفلونزا (IIV)، ويعيش يخفف الإنفلونزا اللقاحات (لايف)5، 7-اللقاحات الثلاثة مصممة لحفز الاستجابة المناعية التكيفية ضد البروتين الفيروسي هكتار، هدفا رئيسيا لتحييد الأجسام المضادة ضد IAVs.
نموذج ماوس المصادق عليها لدراسة IAV العدوى في فيفو
وقد استخدمت نماذج حيوانية لدراسة، بين أمور أخرى، IAV المرضية8،،من910،11، العوامل الفيروسية التي تساهم في المرض12 و/أو انتقال العدوى الفيروسية13 ،14، والأدوية لاختبار فعالية اللقاحات الجديدة أو المضادة للفيروسات9،،من1015. الفئران (Mus musculus) هي نموذج الحيوانية المستخدمة على نطاق واسع معظم البحوث عياف لعدة أسباب: 1) المناعي يشبه تقحم إلى أن هناك حاليا في البشر؛ 2) منخفضة التكلفة، بما في ذلك شراء الحيوان والسكن والإنجاب؛ 3) صغيرة الحجم سهولة التعامل معها وتخزينها؛ 4) تقلب المضيف الحد الأدنى للحصول على استجابات متجانسة والنتائج؛ 5) على معرفة كبيرة بالبيولوجيا الفئران، بما في ذلك تسلسل الجينوم؛ 6) العديد من البيولوجيا الجزيئية المتاحة و/أو الكواشف علم المناعة؛ 7) متاح ضرب الفئران (كو) لدراسة مساهمة البروتين مضيف معين على العدوى الفيروسية؛ و، 8) سلالات الماوس المتعددة التي يمكن استغلالها لتقييم الأساس الوراثي للعدوى.
وهناك عدة سلالات الماوس المتوفرة حاليا لدراسة عياف في فيفو. العمر والحالة المناعية، والجنس، والسلالة الوراثية الخلفية والماوس، فضلا عن طرق العدوى والجرعة وسلالات فيروسية التأثير على نتيجة الإصابة إياف في الفئران. هي سلالات الماوس الأكثر شيوعاً المستخدمة في البحوث IAV C57BL/6، بالب/ج، وفي الآونة الأخيرة، الفئران DBA.2 نظراً لأنهم أكثر عرضه للأمراض إياف من السلالات السابقة هما16،،من1718، 19 , 20-الأهم من ذلك الاستجابة المناعية أيضا يمكن أن تختلف تبعاً للماوس السلالة18،،من1920. وهكذا، المهم جداً لاسترداد كافة المعلومات المتوفرة عن الماوس وسلالة إياف لاختيار أفضل خيار للتجربة التي ستجري.
على الرغم من أن الفأر نموذج حيوان جيد للعدوى في فيفو الدراسات مع عياف، لديهم العديد من القيود، التي تحتاج إلى النظر في التصميم التجريبي. على سبيل المثال، قيداً رئيسيا لاستخدام الفئران في فيفو الدراسات أن لا ترسل IAVs بين الفئران. وهكذا، لانتقال قبول الدراسات، أكثر النماذج الحيوانية (مثلاً، فرت أو خنازير غينيا) هي المستعملة16،،من1721. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من الاختلافات بين مظاهر عياف في الفئران والبشر. بخلاف البشر، لا تتطور الفئران الحمى عند عياف العدوى؛ على العكس من ذلك فإنها تعرض مع انخفاض درجة حرارة الجسم16،17. ويتركز في الفئران، عياف النسخ المتماثل في الجهاز التنفسي السفلي (الرئتين) بدلاً من الخطوط الجوية العليا. وهكذا، ضراوة عياف في الفئران لا يرتبط دائماً بأن ينظر في البشر. بالإجمال، نظراً للمزايا التي تفوق المساوئ محدودة، الماوس يمثل أول نموذج الحيوانات المستخدمة لتقييم أمراض الإنفلونزا الفيروسية، الاستمناع والنجاعة الوقائية في دراسات اللقاحات والأدوية المضادة. وعلاوة على ذلك، سيكون غير مقبولة أخلاقيا لإجراء دراسات مع عياف باستخدام نماذج حيوانية كبيرة دون الأدلة السابقة في نموذج حيوانات صغيرة للعدوى عياف. في هذه المخطوطة، ونحن تصف كيفية تصيب الفئران إينتراناسالي (i.n.) مع عياف وكيفية مراقبة بشدة والتقدم للعدوى الفيروسية وكيفية إجراء التجارب اللازمة لتقييم الاستجابات المناعية خلطيه وفعالية الحماية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج الماوس عياف يستخدم على نطاق واسع في فيفو الدراسات فعالية عياف المرضية، الاستمناع والحماية. الحجم الصغير للفئران يجعلها سهلة لمعالجة وتخزين مقارنة بنماذج حيوانية أخرى مثل النموس أو خنازير غينيا. وعلاوة على ذلك، السهولة من حيث تكلفة الحيوان، السكن والإنجاب السماح باستخدامها في…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أبحاث على فيروس الإنفلونزا في مختبر LM-S تموله جزئيا “نيويورك الإنفلونزا مركز التميز” (نيس)، عضو نييد مراكز التميز “الإنفلونزا للبحث” والمراقبة (سيرس). ونحن نشكر بيتس يندى لها الدعم في تصويبات المخطوطة.
Materials
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice | National Cancer Institute (NCI) | 01XBE | |
| Turckey red blod cells | Biolink Inc | Store at 4°C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4°C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100X | Corning | 30-009-CI | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100X | Corning | 30-00-CI | Store at -20°C |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4°C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4°C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20°C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATTC | H16-L10-4R5 | Store at -20°C |
| Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC | Dako | F0261 | Store at 4°C |
| ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody | GE Healthcare | LNA931V/AG | Store at 4°C |
| TMB substrate set | BioLegend | 421101 | Store at 4°C |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices | ||
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Receptor destroying enzyme, RDE (II) | Denka Seiken Co. | 370013 | Store at -20°C |
| Crystal Violet | Fisher Scienctific | C581-100 | Store at RT |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scienctific | 269620 | |
| Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates | Thermo Fisher Scienctific | 249570 | |
| Puralub Vet Ointment | Dechra | 9N-76855 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | Olympus IX81 |
References
- Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
- Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, 255-264 (2000).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. , (2007).
- Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
- Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
- Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
- Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
- Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
- Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
- Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
- Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
- Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
- Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
- Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
- Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
- Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
- Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857 (2009).
- Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
- Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
- Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
- National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
- Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
- Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
- Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
- He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
- Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
- Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
- Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
- Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).
