タンパク質フィルム赤外線電気化学 [NiFe] ヒドロゲナーゼによって H₂酸化反応に関する研究の実証

図 1は、PFIRE 測定用分光器、グローブ ボックス、ATR アクセサリ、電気化学測定装置、ガスの流れシステムの実験整理の概略図を示します。図 2は、代表分光電気化学セルの図面を示しています。 図 3に示す実験的バッファー (pH 6.0 3.7 で説明されている混合バッファー システム) と、ドロップ キャスト Hyd1 変更粒子の吸光度スペクトル分光電気化学セルを流れます。Hyd1 の表面被覆率は ~ 235 mO.D のアミド II バンド強度を図 3に示す例では特に高い。最低限の「バルク」水によって証明されるよう O H ストレッチ地域 (3,600 ~ 3,000 cm-1) の大きさ 〜 1,640 cm-1、アミド畳み込みバンド基準にして私 Hyd1 のバンドと水 H O 曲げ。C H ストレッチ地域 (カリフォルニア州 2900 cm-1) の蛋白質のための追加のバンドを見ることができます。2,100 cm-1を中心としたブロード バンドは、H2O の分子液体の水における水素結合ネットワークのための制限された回転は、低いエネルギー libration バンドのセットと H O 曲げ振動の組み合わせバンドです。アクティブ サイトの酸化、非アクティブ、Ni B 状態のνCOバンドは明らかに 1,943 cm-1、基線補正がなくても、 νCN機能は 2,050 2,100 cm-1 の間はっきりと見える.高 Hyd1 カバレッジ多くのカーボン ブラック フィルム57の多孔構造が酵素によってブロックされた、PFIRE 測定中に「バルク」水濃度を低くため。 図 3にスペクトルは Hyd1 映画を含む酸化、非アクティブな状態で Hyd1、アクティベーションの前に、ことを示します。活性化 (縮小)マイナス(酸化) 違いの準備としてスペクトルを示す図 4に示すように活性化が −0.8 V 対 H2雰囲気下で SCE が減少の形成につながる触媒活性状態で一晩します。Hyd1。ΝCO領域を使用して、Hyd1 の差スペクトルを最も明確に解釈できます。アクティブ サイトの各一意の状態は 1 つだけ CO バンド 2 つの CN バンドと比較して、従ってνCN地域は本質的により複雑であり、多くの重複するバンド。図 4の差スペクトルは、活性化は酸化、非アクティブな Ni B および Ni – si (‘アクティブ’ 最も酸化した状態) として準備 Hyd1 映画にあった少量の損失 (否定的な吸収バンド) につながることを示しています。これらは Hyd1; の ‘アクティブ’ の状態に置き換えられますNi C、Ni R と Ni l. 注 2 νCOバンドによって証明されるように、Ni R と Ni L の州の両方の 2 つの形態が図 4にこれらの種の観察。複数の Ni R と Ni L 状態の観測は、他の NiFe ヒドロゲナーゼと一致しています。48,58,59 PFIRE メソッドのキーの確認は、サイクリックボルタモが平面の回転ディスク電極に記録されるそれらに類似した触媒ウェーブシェイプ分光電気化学的フロー セル表示中 Hyd1 の記録です。55実習ではこれは基板 (H2) 及び製品 (H+) 分光電気化学セルに固定された Hyd1 への大量輸送は効率的に PFIRE 測定時に使用流量を意味します。触媒の波形に及ぼす流量の影響はに示す図 5連続電位分光電気化学セルによるソリューションの流量が増加すると (1 つの棒) H2雰囲気下で記録を表わす。すべてのケースで、過電圧 Hyd1 H2酸化は同一 (赤影付きの四角形)、酸化の不活性化の程度 (現在の酸化及び還元中間ヒステリシス スイープca 0 V 以上の電位で対SCE)、現在最大の H2酸化がソリューションの流量に依存します。52 mL/分 (光灰色ボルタモ グラム) 触媒の波形はさらに敏感でない上記流量に流量が増加します。 図 6下酸化不活性化嫌気性と初期活性化と 0 V対SCE (Ar 雰囲気で、4.3 で説明したよう) の下で嫌気性再酸化後に Ni B 状態のνCO バンドの相対的強度を比較し(5.1 に従って) 連続実験 V 0対SCE 48 時間後に Ar 雰囲気。測定中はアクティブ サイト バンド強度の損失は認められなかったとされた電位に応答するすべての Hyd1 のサンプル。 図 7は、この作品を通して使用されるベースライン補正手順を示します。アクティブ サイト地域 (図 7、) で Hyd1 サンプルの絶対スペクトルには、水のための重要な曲率が含まれています。実際には、溶媒として水を使用する要件は、生命科学における赤外分光法のほとんどの適用のための問題です。サヴィツキー ゴレイ スムージング 9 ポイント ウィンドウ上で起源のソフトウェアを使用して計算絶対スペクトル (図 7b) の二次導関数は、湾曲した背景 Hyd1 アクティブ サイトのシャープなバンドを識別するために使用できます。2 番目の微分スペクトルを用いた近似的ピーク位置の同定は、アクティブ サイト バンド (図 7で円) 無料の絶対スペクトル領域に配置されるベースラインのアンカー ポイントをことができます。3 次スプライン関数は、Hyd1 活性部位 (図 7起因ピークのみを含むベースライン補正スペクトルを与えるための絶対スペクトルから減算して、ベースライン関数を作成するこれらのアンカー ポイントを装着です。c)。 図 8は、非回転 (Ar 雰囲気中) と電位の範囲で売り上げ高 (H2大気) 条件の下で Hyd1、PFIRE 測定の結果を示します。36現在時間の痕跡 (図 8、) レポート各触媒の現在の可能性を適用し、非回転条件 (Ar 雰囲気中) の下でゼロの現在に近いのまま。図 8bで部分的な分光電気化学的酸化還元滴定は、したがって、各潜在的な触媒の転換の留守中に期待の状態の分布を示すアクティブ サイトの平衡酸化還元挙動に報告します。図 8cのスペクトル (H2大気) の下で回転の条件下で記録された、したがって、アクティブ サイト状態 Hyd1 H2酸化触媒の間に現在の定常状態分布を表します。触媒 H2酸化電流図 8、(H2) −0.199 V、−0.074 V対彼女; 時間の関数として定数に残るという事実によって定常状態が達成されていることを確認しました。+0.356 V 時の電流で単調減衰対Hyd1 のよく知られているの嫌気的酸化不活性化のためです。55活性部位の状態の分布はすべての電位で Ar と H の2の下で明確に異なる Hyd1 が触媒を実行します (図 8b−0.199、−0.074、+0.356 V でスペクトル対彼女)。Ar と H2の下で記録されたスペクトルが −0.594 V対彼女、事実上同じし、これは実験の一貫性の重要なテストを表しますHyd1 は ph 6.0 (図 8、 Ar と H2の下での電流がゼロに近い)、重要な速度で H+を減らさないし、−0.594 V でスペクトルが同じにする見込め。 図 9に示します嫌気的酸化不活性化現在時間トレースに記載されている灰色の時間間隔中に記録されたスペクトルの Hyd1を介して36対 +0.356 で H2酸化 Ni-Ni SI からの B の形成図 9に。−0.074 V Hyd1 酸化不活性化が行われない、活性部位の状態の分布全体の潜在的なステップを通して一定している残る。これは図 9b私、−0.074 潜在的なステップ、および後で記録された図 9biiの冒頭に絶対ベースライン補正スペクトルを報告するスペクトルによって示されて潜在的な段階の時間し、図 9b私の相対的な差スペクトルとして報告されます。図 9biiiのスペクトルとbiv 図 9 b私、相対差スペクトルとしても報告されているし、中に Ni b Ni SI の漸進的変換の可能性を示し不活化、+0.356 V の図 9で示されている現在の単調減少と一貫性のあります。 PH の範囲で記録されたスペクトルは、触媒の Hyd1 中にステップ サイクル プロトン移動に洞察力を与えます。43図 10 pH 3.0 で pH 9.0、分光電気化学セルのソリューション フローを使用して実験のバッファーを交換する同じ Hyd1 フィルムに記録 PFIRE スペクトルを示しています。Ni C と Ni L 状態の相対濃度はこれらの 2 つのスペクトルで明らかに異なっています。非回転の条件下で適用される可能性を変えることによって NiC と Ni L の電位依存性の pH 値 (図 10のb) の範囲に急速に決定することができ、両方の状態は広い pH 範囲で心臓に見られる状態します。(図 10bのピーク吸光度がわかりやすくするため、Hyd1 の滴定は、イダルゴらによって報告されている完全酸化還元 Ni C および Ni L の状態だけを示すことに注意してください)36 Ni C および Ni L の濃度の pH 滴定を抽出できます、Ni C および Ni L の濃度がそれぞれの ph (図 10のc) 最大電位でピーク吸光度を撮影します。この方法で、EPR のデータと組み合わせて、Ni C と Ni L 状態の pH 平衡が確認されました。43 図 1:IR 分光計、嫌気グローブ ボックス、atr、MCT 検出器の配置の模式図ガス フロー システム、ポテンショスタット PFIRE 測定に使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2:入口/出口接続電極およびソリューションの配置を示す PFIRE 測定用分光電気化学セルの概略図。セルとベース プレートは、炭素棒電極接続、Pt ワイヤ カウンター電極、カロメル参照電極と液入口と出口のためのネジ穴と、ポリエーテルエーテルケトン (PEEK) から加工されています。カロメル参照電極構造が以前として報告されます。36この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: Hyd1 変更カーボン ブラック粒子、怒りの上に堆積され、バッファーに退避の吸光度スペクトル。C H 伸縮振動と溶媒の水のための追加機能と一緒に、アミドの私のバンド、アミド II バンド、および Hyd1 活性部位領域の位置が表示されます。差し込みラベルvCOとvCNのバンドと活性部位領域の拡大で表示されます。粒子 ‘ としての準備」にはには、酸化、非アクティブな Ni B 状態で主に Hyd1 が含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: Hyd1 −0.8 V対SCE 削減マイナス酸化差スペクトルとして提示 H2雰囲気下でのアクティブ化。低電位活性化酸化、非アクティブな Ni B (Ni SI の小さな濃度) に変換しますより縮小、アクティブ状態、Ni C Ni R と Ni L. メモ Ni L と Ni R の 2 つの異なるサブ状態を Hyd1 にはこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: 分光電気化学セル触媒サイクリックボルタモ グラムの波形に及ぼすソリューション フロー速度を記録した。H2の流量を増やすことで記録された電位-示されるバッファーを飽和。(赤) 20 mL/分の流量で、ボルタモ グラムは前方スキャン 0 V対彼女上重要な不活性化を示しています。52 mL/分以上の流量で不活性化の程度は非常に低いと電流がすべてポテンシャルにおける流量の独立しました。その他のパラメーター: 1 H2、10 mV/秒のスキャン レート バー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6: ベースライン修正 0 V対SCE で酸化、非アクティブの Ni B 状態のアクティブ サイトνCO 地域に IR スペクトル。48 時間連続の PFIRE 測定の中には活性部位の強度の測定可能な損失、カーボン ブラック粒子のため Hyd1 は確実に吸着します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 7:データ処理に使用されるベースライン補正手順の詳細します。ベースラインのアンカー ポイントは、 νCOとνCNのピーク第 2 デリバティブ分析 (b) から特定を避けるために世話 (、)、アクティブ サイト地域における絶対吸光度スペクトル上に配置されます。結果として得られるベースライン修正されたスペクトルは、(c) に表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 8:非 (Ar) 売り上げ高と売り上げ高 (H2) 条件の下で Hyd1 の PFIRE 測定。Ar 飽和 (グレー) と H2の分光電気化学セルに Hyd1 の (、) 現在時間の痕跡-飽和 (黒) バッファー;(b)、(c) PFIRE スペクトルνCO [Ar (b) と (c) H2可能性のある地域を示します。電位 V対の引用符で囲まれた彼女。イダルゴらの許可を得て再現35この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 9:Ni-Ni SI からの B の形成を介してHyd1 の嫌気性不活化します。(、)、+0.356 V、−0.074 V と遅い嫌気性不活化 (現在の単調減少) で現在安定した触媒を示す H2雰囲気下で現在時間トレース対彼女。(b) スペクトルがでマークされている灰色の影の領域の中に記録された (、)。スペクトル b私は −0.074 V の潜在的なステップの先頭に記録されたベースライン補正スペクトルです。スペクトル bii−0.074 V ステップの間に後で記録は b は私の相対的な差スペクトルとして報告され、−0.074 V の電位の安定性と一貫性のあるアクティブ サイトの状態の分布の変化が発生しないことを示します。Iv b は私の相対的な差スペクトルとしても報告されているし、+0.356 V で嫌気性の不活性化過程における Ni b Ni SI の漸進的な変換を示すスペクトル biiiと b対彼女。イダルゴらの許可を得て再現35この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 10: プロトン移動に洞察力を与える pH の範囲で記録されたスペクトルで、Hyd1 の触媒サイクル中に手順します。Hyd1、 νCO領域を示す (、) IR スペクトルは pH 3.0 (-54 mV対彼女) と pH 9.0 (-334 mV対彼女) に記録されます。(b) 分光電気化学の滴定は Ni C, Ni-L の濃度がソリューション pH 値の範囲での最大値ではポテンシャルを決定するを行った。わかりやすくするため、Hyd1 を参照してくださいイダルゴらの完全分光電気化学滴定の Ni C, Ni-L の濃度のみが表示されます。Ni C と一連の (b) に示すような実験から決定された Ni-l の相対濃度の36 (c) pH 依存性。20 ° C で記録されたスペクトルMurphyらからの許可と適応42この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。