JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Deutsch

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Published: December 04, 2017
doi:
10.3791/55858
, ,
1Department of Chemistry,University of Oxford, Inorganic Chemistry Laboratory

Summary

Hier beschreiben wir eine Technik, die Protein Film Infrarot-Elektrochemie, wodurch immobilisiert Redox Proteine unter direkter elektrochemischer Kontrolle eine Kohlenstoffelektrode spektroskopisch untersucht werden. Infrarot-Spektren einer einzigen Proteins Probe können eine Reihe von angewandten Potenziale und unter einer Vielzahl von Lösungsbedingungen aufgezeichnet werden.

Abstract

Verständnis der Chemie der Redox Proteine Anforderungen Methoden, die präzise Kontrolle über Redox-Zentren innerhalb des Proteins. Die Technik des Proteins Film Elektrochemie, in denen ein Protein auf eine Elektrodenoberfläche immobilisiert ist, so dass die Elektrode physiologischen Elektron Spender oder Akzeptoren, ersetzt hat funktionelle Einblick in die Redox-Reaktionen einer Reihe von unterschiedlichen zur Verfügung gestellt. Proteine. Vollständige chemische Verständnis erfordert eine elektrochemische Steuerung mit anderen Techniken kombiniert werden, die zusätzliche strukturelle und mechanistische Einblicke hinzufügen können. Hier zeigen wir eine Technik, die Protein Film Infrarot-Elektrochemie, das Protein Film Elektrochemie mit Infrarot-Spektroskopie Probenahme von Redox-Proteinen verbindet. Die Technik nutzt eine abgeschwächte totale Reflexion Multiple-Reflexion-Geometrie, ein Redox-Protein immobilisiert auf eine große Oberfläche Ruß Elektrode Sonde. Einbeziehung dieser Elektrode in einer Durchflusszelle ermöglicht Lösung pH oder gelöste Konzentrationen während der Messung verändert werden. Dies ist besonders leistungsfähig bei der Bewältigung Redox Enzyme, wo schnelle katalytischen Umsatz nachhaltig und an der Elektrode so dass spektroskopischen Beobachtung von langlebigen zwischen-Arten in der katalytischen Mechanismus gesteuert werden kann. Wir zeigen die Technik mit Experimenten auf E. Coli Hydrogenase 1 Umsatz (H2 Oxidation) und nicht-Umsatz-Bedingungen.

Introduction

Eine zentrale Herausforderung in der Studie der Proteinfunktion umfasst die Entwicklung von in Situ -Methoden, die es ermöglichen, dass die direkte Beobachtung von Proteinen, die Durchführung ihrer physiologischen Rollen, entweder in Vivo oder Proteinproben isoliert. Dies erfordert die Integration von Steuerung oder in experimentellen Verfahren und Einsatz von kombinierten Techniken, mit denen sowohl die Reaktivität zu prüfenden Prozesse auslösen und chemischen Einzelschritten während Proteinfunktion gleichzeitig gemessen werden. Bei Redox-Proteinen entspricht dies oft Kombination elektrochemische Techniken, die präzise Kontrolle der angewandten Potenzial aber bieten keine direkte chemische Informationen mit spektroskopischen Techniken, die empfindlich auf chemisch-spezifische Veränderungen im Zusammenhang mit Proteinfunktion. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry ist ein allgemeiner Begriff für eine Reihe von gekoppelten elektrochemische und spektroskopische Methoden, die eine Vielzahl von spektroskopischen Techniken und elektrochemische Steuerungsebenen umfassen. Viele Proteine können Elektronen mit künstlichen, lösliches Elektron Spender und Akzeptoren austauschen und dies wurde in Studien die kleine Moleküle zu verwenden, um Elektronentransfer, einschließlich Kupplung mit UV-VIS,4,5 vermitteln ausgeschöpft , 6 , 7 magnetische kreisförmigen Dichroismus8 und Infrarot-5,9,10,11,12,13,14 (IR) Spectroscopies. In einer begrenzten Anzahl von Fällen erwies es sich möglich, unmittelbare, Diffusion-kontrollierte Elektron Austausch zwischen Proteinen und Elektroden zu nutzen. 15 , 16

Für katalytische Reaktionen durchgeführt durch Redox Enzyme, Elektrochemie Lösungsansätze vorhanden einen klaren Nachteil. Diffusion-gesteuerte Elektron Übertragung über Redox Mediatoren in Lösung ist wahrscheinlich zu Bandbreitenbegrenzung. Kinetische und mechanistische Informationen über das Enzym kann verloren gehen, oder zumindest schwer zu deconvolute von Diffusion Artefakte aus der experimentellen Methode geworden. Direkte, unmittelbare elektrochemische Kontrolle ist daher ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von Redox-Proteinen und Enzymen. Die Technik des Proteins Film Elektrochemie (PFE) beschäftigt Redox-Elektrode immobilisierten Proteine, in einer Weise, dass Elektronen direkt an oder aus der Redox-Cofaktoren in das Protein übertragen werden, da die Elektrode an einer Reihe von Potentialen polarisiert ist. 17 , 18 , 19 PFE ist von besonderem Wert für die Erforschung der Oxidation oder Reduktion Reaktionen katalysiert durch Redox-Enzyme, wie Grenzflächen Elektronentransfer mit einer sehr hohen Geschwindigkeit erreicht werden kann. Beispielsweise wurde die elektrokatalytische Fluktuationsrate von Nickel-Eisen ([NiFe]) Hydrogenase aus Allochromatium Vinosum ca 1.000-10.000 s−1 für H2 Oxidation von PFE gemessen. 20 mögliche Elektrode wirkt als Auslöser, Katalyse “on” oder “aus” und die elektrokatalytische aktuelle Berichte über die Enzymaktivität zu machen. PFE ist daher eine wertvolle Methode zur Analyse der Reaktivität von komplexen Enzymen, die innig, Potenzial, wie Reaktionen der di-Eisen aktiven Seite des [FeFe abhängen]-Hydrogenasen mit CO und O2,21 oder Potenzial-induzierte Inaktivierung Reaktionen der Hydrogenasen, Kohlenmonoxid-Dehydrogenase22 ,23 und andere komplexe Redox-Enzyme. 24

Das wichtigste Hindernis für Kombination von spektroskopischen Techniken mit der elektrochemischen Direktsteuerung gewährten PFE ergibt sich aus der niedrigen Flächendeckung der Redox-Enzyme in der Größenordnung von 1-2 Pmol cm-2 für die [NiFe] Hydrogenase von A. Vinosum, 20 im Vergleich zu in Situ Oberflächenforschung Studien von niedermolekularer Adsorbate auf Masse Metall-Elektroden. Dies stellt eine Herausforderung für die Empfindlichkeit der spektroskopischen Messung. Verschiedene Spectroelectrochemical Methoden gemeldet wurden für die Untersuchung immobilisiert Redox-Proteine auf eine Reihe von verschiedenen Elektroden: UV-VIS Spektroskopie an transparenten Metalloxid Elektroden; 25 , 26 , 27 -Fluoreszenz-Spektroskopie bei gold-Elektroden; 28 , 29 -Oberfläche verbessert Infrarotabsorption (SEIRA) Spektroskopie an gold-Elektroden; 30 , 31 , 32 , 33 und Oberfläche enhanced Raman spektroskopische Techniken, vor allem an Silber-Elektroden. 34 , 35

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kupplung PFE mit IR-Spektroskopie, in einer Technik bekannt als Protein Film Infrarot-Elektrochemie (PFIRE). 36 die PFIRE Methode studiert Redox-Enzyme, die auf eine große Oberfläche Kohlenstoff Arbeitselektrode in Verbindung mit einer abgeschwächten totale Reflexion IR (ATR-IR) Geometrie, nutzen die Leichtigkeit der Adsorption von eine Reihe von Proteinen auf Carbon-Oberflächen immobilisiert. IR-Spektroskopie ist nützlich in Studien von Redox-Enzymen und Proteinen wie viele kleine Moleküle, Liganden und Cofaktoren diagnostische Absorptionswerte, die zur Reaktivität, Bindung, Hemmung und Redox-Zustand Beurteilung herangezogen werden können. Beispiele hierfür sind die Bindung von NO zu Eisen-Schwefel-Zentren,37 Studie der Flavoproteine,38,39,40 kleines Molekül binden an Häm-Zentren etc.. 41 die ATR-IR-Geometrie ermöglicht eine optimierte 3-Elektrode (Spectro) elektrochemische Zelle42 und bietet somit hervorragenden elektrochemischen Kontrolle. Lösung Widerstand und mögliche Drift werden minimiert, indem man eine Referenzelektrode nah an der Arbeitselektrode. Große Oberfläche Zähler Elektroden dienen, die kompatibel mit hohe elektrokatalytische Strömungen durch schnelle Enzym Umsatz an der Arbeitselektrode produziert sind. Lösung durch die Spectroelectrochemical-Zelle ermöglicht einfache Kontrolle über die Konzentration der Substrate, Inhibitoren und pH. 36 , 43 , 44 die PFIRE Methode ermöglicht somit IR Spektren, aufgezeichnete in Situ während nachhaltige Enzym Electrocatalysis zu sein. 36 , 44 PFIRE ist auch in der Lage, chemische Informationen in Ermangelung von katalytischen aktuell43 im Gegensatz zu PFE wo es Informationsextraktion aus nicht-katalytischen Prozessen in Redox Enzyme schwierig sein kann. 45 , 46

Wir haben die PFIRE-Methode für die Studie der elektrokatalytische H2 Oxidation von [NiFe]-Hydrogenasen, bewiesen die intrinsische CO und CN Liganden koordiniert nach Fe an einem Bimetall aktiv-Standort enthalten. 36 , 43 , 44 [NiFe]-Hydrogenasen eignen sich deshalb besonders gut, um PFIRE zu studieren. Die PFIRE-Methode liefert Informationen über die Arten, die bei stationären Umsatzes anwesend sind, und somit entscheidende mechanistischen Erkenntnis neben der Fülle von Literatur auf IR-Spektroskopie der Hydrogenasen ohne experimentelle Kontrolle Umsatz. 47 , 48 Dyer und Mitarbeiter haben Beschäftigte zeitaufgelösten IR Methoden der NiFe Hydrogenasen,49,50,51 mit einen leichten Trigger entweder einen kleinen negativen möglichen Schritt (über Gebrauch anwenden zu studieren der Lösung Mediatoren und ein “Käfig” Elektronenquelle) oder Photolyse gebundene Hydrid. Obwohl die PFIRE-Methode derzeit Zeitauflösung entsprechen diese Messungen40 zur Verfügung stellen kann, es ermöglichen Studium der reduktiven und oxidative katalytischen Prozessen, Zugriff auf eine Reihe von klar definierten Potentiale und frei von Stofftransport Einschränkungen.

Die PFIRE-Methode unterscheidet sich von SEIRA Studien von Redox-Proteine, die auch eine ATR-IR-Geometrie und beschäftigen eine nanoskalige aufgeraut Metallelektroden, die IR-Absorption der Moleküle adsorbiert an der Elektrodenoberfläche zu verbessern. 30 SEIRA ist eine äußerst wertvolle Technik zur Untersuchung der Membranproteine, insbesondere auf adsorbiert oder in mimetischen Membran Architekturen,32 aber das Bedürfnis nach einem Metall-Elektrode kann begrenzen Substrat und Inhibitor durch Reaktivität der Elektrode Unterstützung gegenüber kleinen Molekülen wie CO, CN–, CO2 etc. Proton-Reduktion und selbst-zusammengebauten monomolekularen Film Desorption auf Metalloberflächen bei sehr negativen Potentiale problematisch sein können, wurde1,52 obwohl Enzym Electrocatalysis auf ungeschützten-Elektroden Metall berichtet. 53 , 54 ein Nachteil des PFIRE relativ SEIRA ist die relative Schwierigkeit der Einbeziehung von Membranproteinen in native oder mimetischen Membran-Architekturen. Allerdings macht die relative chemische Inertheit der Kohleelektroden zu konkurrierenden niedermolekularer Aktivierung Reaktionen PFIRE eine hervorragende Technik für das Enzym Electrocatalysis, besonders im Bereich Low-Potential für biologische Redox Studium Prozesse wie Proton Reduktion von Hydrogenasen. 1 , 43

Das Ziel dieses Artikels ist, die PFIRE-Methode als eine Technik zur Untersuchung Redox-Elektrode immobilisierten Proteine, mit NiFe Hydrogenase 1 (Hyd1) von Escherichia coli als Vorbild einzuführen. Überlegungen der Probenvorbereitung, die Voraussetzung für gutes Substrat Fluss und Datenverarbeitung werden diskutiert. PFIRE ist eine allgemein anwendbare Technik, gut geeignet für Studium Redox-Protein (mit charakteristischen IR Absorptionswerte), das auf Kohleelektroden, entweder direkt adsorbiert werden kann oder mit Oberflächenmodifizierung, so dass es Elektronen mit austauschen kann die Elektrode.

Protocol

(1) neu die internen Probenraum ein FTIR-Spektrometer in einem anaeroben, trockenen Glovebox und allgemeine experimentelle Anforderungen Verwenden Sie eine kommerzielle FTIR-Spektrometer mit externen Quecksilber Cadmium Tellurid (MCT) Detektor und ATR Zubehör ausgestattet. Löschen Sie den Körper des Spektrometers mit trockener Luft oder Distickstoff, oder verwenden Sie alternativ ein Spektrometer mit einer evakuierten optischen Bank. Legen Sie das Spektrometer auf eine stabile und vibrationsfreie Tisch auf der gleichen Höhe wie eine anaerobe (< 1 ppm O2), trocknen (Taupunkt <-75 ° C) Glovebox. Leiten Sie den IR-Strahl des Spektrometers in das Handschuhfach, durch ein IR-transparente Fenster, das groß genug für den defokussierten Strahl ist.Hinweis: Es ist wichtig, dass der Abstand zwischen dem Handschuhfach und Spektrometer ist auch gelöscht oder evakuiert, besonders wenn eine hygroskopische Fenstermaterial, z. B. NaCl oder KBr beispielsweise verwendet wird. Replizieren Sie die internen Probenraum des Spektrometers in das Handschuhfach. Richten Sie den Strahl in das Handschuhfach auf einer einfallenden Ellipsoid Spiegel, idealerweise mit gleicher Brennweite als interne Fokussierung Spiegel des Spektrometers.Hinweis: Es ist nützlich, um zwei weitere Planspiegel vor dieser Fokussierung Spiegel platziert, um die Höhe und Richtung der IR-Strahl in das Handschuhfach angepasst werden können; gegenläufig wird jede Ungenauigkeit bei der anfänglichen Platzierung des Spektrometers. Legen Sie einen externe MCT-Detektor, komplett mit einem geeigneten mit Schwerpunkt Optik (z. B. eine kurze Brennweite ZnSe oder einfallenden Parabolspiegel mit einer kurzen Brennweite) innerhalb der Glovebox positioniert wie die Dimensionen der internen Stichprobe replizieren Fach des Spektrometers. Einstellen Sie “Schärfe” von den IR-Strahl zu ungefähr äquidistant zwischen der fokussierenden Spiegel und der MCT-Detektor. Cool das Dewar von externen MCT-Detektor mit flüssigem Stickstoff. Montieren Sie das ATR-Zubehör in der Glovebox Probenraum. Richten Sie die ein- und Ausgabe mit Schwerpunkt Optik und ATR Accessoire für maximalen Durchsatz an den MCT-Detektor zu erreichen. Verwenden Sie ggf. eine Blende oder andere geeignete Dämpfung (z. B. dem Drahtnetz), Übersättigung des Detektorsignals zu verhindern.Hinweis: für die hier vorgestellten Daten, eine fünf-Reflexion ATR Accessoire mit allen reflektierende Optik und eine abnehmbare trapezförmige Si interne Reflexion Element (IRE) verwendet wird (Crystal GmbH, Maße ca 5 × 8 × 1 mm3, Gesicht Winkel 39,5 °). Das IRE wird in einem abnehmbaren Bodenplatte gefertigt aus Polyether-Ether-Keton (PEEK) montiert. Eine Glovebox verwenden, um die neu erstellte Probenraum mit geeigneten Durchführungen ermöglichen Anschluss an ein extern untergebracht Potentiostaten Haus (Gas Dichte BNC-Verbindungen eignen sich für diesen Zweck), Gas-Zugang und Kabel übertragen das Signal aus der MCT Detektor. Es ist wichtig, erhalten Abschirmung am Detektor Kabel einführen Rauschen oder Interferenzen mit den Messungen zu vermeiden. Legen Sie eine Schlauchpumpe, in der Lage, Strömungsgeschwindigkeiten größer als 60 mL/min in das Handschuhfach. Eine schematische Darstellung des Spektrometers ist ATR Zubehör, peristaltische Pumpe und Potentiostaten Setup in Abbildung 1dargestellt. Eine Spectroelectrochemical Zelle, wie Sie schematisch in Abbildung 2, die auf der ATR Dichtungen Zubehör zu konstruieren. Die Zelle sollte eine hohe Oberfläche Gegenelektrode (Pt-Draht oder Gaze), einen Anschluss für die Arbeitselektrode (Kohlestab) und ein Miniatur-Referenzelektrode enthalten. Die Zelle sollte mindestens zwei weitere Ports als Einlass und Auslass für schnelle Strömung der Lösungen durch die Zelle enthalten.Hinweis: Eine Miniatur gesättigt Kalomel Bezugselektrode ist ideal für diesen Zweck. 36 2. Vorbereitung des Ruß-Partikel mit E. Coli Hydrogenase 1 geändert In einer “nassen” anaerobe Glovebox mix 20 mg hohe Fläche Ruß Partikel (> 1.000 m3/g) mit 1 mL höchste Reinheit Wasser (Widerstand > 18 MΩ cm) in einem Microcentrifuge Schlauch. Die Partikel durch stromsparende Ultraschallbehandlung zu zerstreuen (< 100 W) für mindestens 15 Minuten, oder bis die Dispersion ist einheitlich und tut nicht Sediment innerhalb 1 h um eine Ruß-Dispersion mit einer Belastung von ca. 20 mg/mL zu geben. Nehmen Sie eine Aliquote von E. Coli Hydrogenase 1 (Hyd1, etwa 50 µL, zubereitet nach einem veröffentlichten Verfahren55) in einer Konzentration von ~ 7 mg Protein/mL und tauschen Sie es in einen Puffer geringer Ionenstärke bei einem pH-Wert nahe dem isoelektrischen Punkt (bei Beispiel Kalium Phosphat, 15 mM, pH 5.8, kein zusätzliches Salz). Um beste Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie ein Enzympräparat, die so aktiv wie möglich ist. Führen Sie die Buffer Tausch durch Konzentration und Verdünnung in eine zentrifugale Filter-Gerät mit einer entsprechenden Molekulargewicht cutoff (50 kDa funktioniert gut für Hyd1). Fügen Sie die Hyd1 auf das Filter-Gerät. Mit rund 450 µL Austausch Puffer verdünnen. Aufkonzentrierung auf ein Volumen von 50 µL mit milden Zentrifugation (< ~ 2700 × g) irreversibel Niederschlag zu verhindern. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 und 2.2.3 bis Buffer Tausch (in der Regel innerhalb von ~ 5 Zyklen) abgeschlossen ist. Mischen Sie ein 5 µL Volumen von 20 mg/mL Ruß Dispersion (vorbereitet in 2.1) mit 50 µL Aliquot der Puffer ausgetauscht Hyd1. Bewahren Sie die Enzym-Partikel-Mischung im Kühlschrank auf (bei 0 ° C) über Nacht damit das Enzym zu adsorbieren kann. Es möglicherweise notwendig, schütteln Sie die Mischung gelegentlich, um sicherzustellen, dass die Partikel zerstreut bleiben. Waschen Sie die Hyd1 modifiziert Teilchen mit geringer Ionenstärke Puffer (Kalium-Phosphat, 15 mM, pH 5.8, kein zusätzliches Salz) von aufeinanderfolgenden Sedimentation und erneute Dispersion Zyklen in einem Microcentrifuge (~ 2.700 × g). Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 – 5 Mal, nicht adsorbiert Enzym zu entfernen.Hinweis: Vor der ersten Wäsche sollte der Überstand nahezu farblos, zeigt gute Adsorption des Enzyms sein. Konzentrieren sich die Partikel zu einem Endvolumen von ~ 5 µL, um eine endgültige Beladung von ~ 20 mg/mL der Enzym-modifizierte Teilchen geben.Hinweis: Die Hyd1-modifizierte Partikel können gespeichert werden bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen wenn sie hydratisiert bleiben; Dies geschieht am besten durch Speicherung von Teilchen mit ~ 50 µL höchste Reinheit Wasser verdünnt. 3. Vorbereitung für PFIRE Messungen auf E. Coli Hydrogenase 1 Reinigen Sie das Si IRE Niedrigstrom-Beschallung (< 100 W), zunächst in H2SO4 (< 90 % w/w) für ca. 15 min, und dann in Druckaufschluss3 (70 % w/w) für bis zu 1 Stunde. Dieses Reinigungsverfahren sollte zu einer hydrophilen IRE Oberfläche führen. Wenn weitere Reinigung erforderlich ist kann der Zorn in Piranha Lösung gelegt werden (Verhältnis 1:3 H2O2: H2SO4) eventuell verbleibende organische Material zu oxidieren.Hinweis: Harten saure Reinigungsmethoden geeignet für den Einsatz mit allen IRE Materialien möglicherweise nicht. Piranha-Lösung ist stark ätzend und ein starkes Oxidationsmittel, Oberflächen sollten sauber sein, bevor Verwendung von Piranha-Lösung und Sorgfalt, während der Zubereitung getroffen werden und Verwendung von Piranha Lösung aufgrund der exothermen Prozess – immer hinzufügen H2O 2 langsam zu H2SO4 und beziehen sich auf die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen für Vorbereitung, Nutzung und Entsorgung. Die saubere IRE in höchster Reinheit Wasser spülen und Trocknen unter einem Strom von trockenem Stickstoffgas. Alle Prism Umgang mit einer sauberen Pinzette zur Vermeidung von Kontaminationen führen. Versiegeln Sie den Zorn in der ATR Zubehör Grundplatte mit einem dünnen Streifen von Elektro-Silikon-Dichtstoff. Achten Sie darauf, um die Dichtmasse an den Rändern des IRE zu beschränken. Lassen Sie der Dichtstoff vollständig trocknen. Die ATR-Zubehör-Grundplatte auf das Spektrometer Handschuhfach übertragen und auf der ATR-Zubehör montieren. Maßnahme ein Referenzspektrum (Hintergrund) zwischen 4000-1.000 cm-1 4 cm-1 Auflösung, mit der standard Rapid scan Modus des Spektrometers und 1024 gemittelten Interferogrammen (Messung Zeit ~ 3-5 min). Nutzen Sie dieses Spektrum als Eingabe um Berechnung der Absorption Spektren später im Experiment zu ermöglichen.Hinweis: Aufgrund der kleinen Extinktion für Hyd1 aktiven Seite erwartet ist es notwendig, Spektren mit high-Signal zu Rausch-Verhältnis zu sammeln. Übertragen Sie die ATR Zubehör Bodenplatte auf der “nassen” Glovebox enthält die vorbereiteten Hyd1 veränderten Partikeldispersion (Abschnitt 2). Drop-Besetzung eine aliquote 1 µL der Partikeldispersion auf der großen Fläche des IRE, und verteilen sie gleichmäßig über die Oberfläche. Hinweis: Lassen Sie nicht die Partikel auf den Zorn völlig trocken werden. Schneiden Sie ein Stück von Kohlepapier, z. B. als Gas-Diffusion-lagen-Material in Brennstoffzellen, um eine Größe ~0.1 mm kleiner als die Oberfläche Abmessungen des IRE (d.h. ca. 8,2 × 4,9 mm2). Die Fläche von der Kohlepapier sollte groß genug, um die Drop-Cast Hyd1 veränderten Partikel zu decken, aber nicht so groß, überschneiden sich die Silikon-Dichtstoff verwendet, um den Zorn zu sichern. Einweichen Sie das Kohlepapier in Wasser, und legen Sie sie vorsichtig über den oberen Teil der Partikel-Film. Das Kohlepapier bieten eine gute elektrische Verbindung über die ganze Partikel-Film.Hinweis: Es empfiehlt sich, mehrere Stücke von Kohlepapier im Voraus vorzubereiten, und sie eingeweicht in Wasser höchster Reinheit in der “nassen” anaerobe Glovebox speichern. Montieren Sie die Spectroelectrochemical Zelle (1.7 beschrieben und schematisch in Abbildung 2dargestellten) über den Zorn, in die Bodenplatte mit Schrauben sichern. Fügen Sie ~ 200 µL des experimentellen Puffers, das Enzym hydratisiert zu halten. Eine gemischte Puffersystem zur Pufferung über einen weiten pH-Bereich eignet sich für Studien über NiFe Hydrogenasen:56 Natriumacetat, 2-[N”-Morpholino] Ethan-Sulfo Säure (MES), N’-[2-Hydroxyethyl] Piperazin -N” -[2-Ethan-Sulfo Säure] (HEPES), N’-Tris [macht]-Methyl-3-amino-Propan-Sulfo-Säure (TAPS) und 2-[N’-Cyclohexylamino] Ethan-Sulfo Säure (CHES), mit jeder Komponente auf eine Endkonzentration von 15 mM und mit 0,1 M konzentrierte NaCl als unterstützende Elektrolyt, mit pH-Wert eingestellt mit pH 6 NaOH und HCl.Hinweis: Die funktionierende Elektrode Verbindung ragen sollten leicht unterhalb der Ebene der Spectroelectrochemical Zelle oben (~0.1 mm), gute elektronische Anbindung an das Kohlepapier (Abbildung 2) zu gewährleisten. Ein Flow-System mit peristaltischen Pumpe Schlauch und ein Fläschchen des Puffers experimentelle herstellen Sie Lösung zu- und Ablauf der Spectroelectrochemical Zelle. Übertragen Sie die montierte Zelle auf der “trockenen” Glovebox mit dem Spektrometer. Montieren Sie die Spectroelectrochemical Zelle Assembly auf die ATR-Zubehör. Schließen Sie die Arbeits-, Zähler und Referenzelektroden an dem Potentiostaten. Den peristaltischen Pumpe Schlauch an die Pumpe anschließen. Ein Absorptionsspektrum mit 1024 gemittelt Interferogrammen mit 4 cm-1 Auflösung über einem Spektralbereich von 4.000-1.000 cm-1aufnehmen, mit dem Spektrum als Referenz/Hintergrund in 3.4 gesammelt. An dieser Stelle sollte das Spektrum erhebliche enthalten (> 100 mO.D.) Amid II bands bei ~ 1.540 cm-1 und aktiven Bands der Hyd1 sollte in den Spektralbereich 1.850-2.150 cm-1, weitgehend in oxidiert, inaktive Staaten (Abbildung 3 ersichtlich ). (4) Aktivierung von E. Coli Hydrogenase 1 und Tests der Spectroelectrochemical Zelle Hyd1-modifizierte Partikel Film eine Verringerung Potenzial (−0.8 V Vs SCE) zuweisen. Den experimentelle Puffer mit H2 und Flow Puffer langsam durch die Spectroelectrochemical-Zelle zu sättigen. Lassen Sie die Probe über Nacht voll die Hyd1 aktivieren.Hinweis: Es ist wichtig, anaerobe H2, N2 etc.und so alle anaeroben Gase verwenden sollte durch einen O-2 -Filter übergeben werden. Zeichnen Sie ein Absorptionsspektrum der Probe nach der Aktivierung. Die νCO und VCN Bands der aktiven Seite sollte nun eine Verteilung der reduzierten, “aktive” Staaten zeigen. Dies wird am einfachsten durch den Einsatz von ein Unterschied-Spektrum, bezogen auf das Spektrum verzeichneten 3.10 (Abbildung 4) beobachtet. Testen Sie die elektrische Verbindung der Spectroelectrochemical Zelle. Um dies zu tun, sättigen Sie die experimentelle Puffer mit N2 Gas. Anwenden einer Abfolge von oxidierenden (0 V Vs SCE) und (−0.8 V Vs SCE) Potenziale ( ca 30 min Dauer) auf der Hyd1-modifizierte Partikel-Film zu reduzieren, und zeichnen ein Absorptionsspektrum jeweils. Die Hyd1 rasch oxidiert und reduziert werden sollte, und wenn der Partikel-Film gut verbunden ist 100 % der Stichprobe sollte reagieren auf das angewandte Potenzial. Eine entsprechende Durchfluss des experimentellen Puffers gesetzt. Um dies zu tun, gelten Sie eine Verringerung Potenzial (−0.8 V Vs SCE) zur Probe, und sättigen Sie den experimentellen Puffer mit H2. Eine Reihe von zyklischen Voltammograms zwischen-0.707 Rekord – 0.039 V Vs SCE mit einer Scanrate von 10 mV/s erhöhen die Strömungsgeschwindigkeit des H2-gesättigten Puffer zwischen Voltammograms bis die katalytische Wellenform, die bei einer planaren rotierenden ähnelt CD-Elektrode55 und der maximale Strom ist unabhängig vom Durchfluss (Abbildung 5).Hinweis: Die Löslichkeitsgrenze von H2 in Wasser beträgt ~0.8 mM bei 293 K und 1 Bar. Da die Probe jetzt bereit für PFIRE Messungen, sammeln Sie Spektren in einem Bereich von Potentialen, unter einer Reihe von Lösungsbedingungen (pH-Wert, Temperatur, H2 Konzentration etc.). Notieren Sie alle elektrochemische Daten mit Hilfe der Potentiostaten Software, da es wichtig ist, spektroskopische und elektrochemische Daten korrelieren vor allem, wenn elektrokatalytische Prozesse wie H2 Oxidation durch Hyd1 studieren zu können. (5) spektroskopische Daten-Handling Bestätigen Sie, dass die aktive Website nicht dauerhaft im Verlauf der Messungen geändert wurde durch die Aufnahme von Spektren bei 0 V und −0.8 V Vs SCE am Ende des Experiments. Diese sollte identisch mit den Spektren in 4.3 aufgezeichnet werden, und kein Verlust des aktiven Zentrums sollte während der Messung (Abbildung 6) beobachtet werden. Absolute Absorption Spektren aus der Spektrometer-Software in ein geeignetes Format exportieren (CSV, ASCII, “Matlab”, Jcamp etc.) für die Bearbeitung mit einer Software wie Herkunft oder Matlab. Grundlinie korrigieren Sie die Daten mithilfe des Prozesses in Abbildung 7dargestellt. Die zweite Ableitung der einzelnen Absorptionsspektrum im Bereich 1.800-2.150 cm-1, zu ergreifen, um kleine identifizieren (< 1 mO.D.) aktiven bands vor dem Hintergrund der stark gebogenen Wasser. Grundlinie Markierungspunkte auf der ursprünglichen Absorptionsspektrum und Sollwerte um das experimentelle Spektrum zu fangen. Passen Sie eine Grundlinie durch die Punkte mit einer interpolierten kubische Spline-Funktion oder eine Polynomfunktion. Subtrahieren Sie diese Basislinie Funktion aus den experimentellen Daten.

Representative Results

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung die Spektrometer, Handschuhfach, ATR-Zubehör, Potentiostaten und Gas-Flow-System für PFIRE Messungen verwendet. Abbildung 2 zeigt eine aussagekräftige Zeichnung der Spectroelectrochemical Zelle. Abbildung 3 zeigt Absorption Spektren von Drop-Cast Hyd1 veränderten Partikel mit dem experimentellen Puffer (eine gemischte Puffersystem, beschrieben in 3.7, pH 6.0) durch die Spectroelectrochemical Zelle fließt. Die Flächendeckung der Hyd1 ist besonders hoch in dem Beispiel in Abbildung 3, Amid II Band Intensität ~ 235 mO.D. und minimale “Massen” Wasser als belegt durch das Ausmaß der O-H-stretching-Region (~ 3.000-3.600 cm-1) im Verhältnis zu der Band bei ~ 1.640 cm-1, die eine Faltung der Amid ist ich Band des Hyd1 und der Wasser H-O-H-Kurve. Zusätzlichen Bänder durch das Protein können in der C-H-stretching-Region (ca. 2900 cm-1) gesehen werden. Die breite Band zentriert um 2.100 cm-1 ist eine Kombination Band der H-O-H biegen Schwingung mit einer Reihe von unteren Libration Energiebänder, die eingeschränkte Rotationen von H2O Moleküle durch das Wasserstoff-Bindung-Netzwerk in flüssigem Wasser sind. Die νCO Band von oxidierten, inaktiv, Ni-B-Status der aktiven Seite ist deutlich bei 1.943 cm-1, auch ohne Basislinienkorrektur, und νCN Funktionen sind deutlich sichtbar zwischen 2.050-2.100 cm-1 . Bei hohen Hyd1 Bedeckungen Großteil der mikroporösen Struktur des Rußes Film57 wird durch Enzym blockiert und deshalb sinkt die “Massen” Wasser-Konzentration bei PFIRE Messungen. Die Spektren in Abbildung 3 zeigen, dass vor der Aktivierung, Hyd1 Filme Hyd1 in oxidiert, inaktive Staaten enthalten. Aktivierung über Nacht bei −0.8 V Vs SCE unter einer H2 Atmosphäre reduziert, führt zu Bildung von katalytisch aktive Zustände, wie in Abbildung 4 gezeigt, die eine aktivierte (reduzierten) minus als vorbereitet (oxidiert) Unterschied Spektrum zeigt der Hyd1. Unterschied-Spektren der Hyd1 können am deutlichsten mit νCO Region interpretiert werden. Jeder eindeutigen Zustand der aktiven Seite hat nur eine CO-Band im Vergleich zu zwei CN Bands und νCN Region ist daher per se etwas komplizierter, mit vielen überlappenden Bands. Das Spektrum der Unterschied in Abbildung 4 zeigt, dass Aktivierung führt zu einem Verlust (negativer Absorptionsbanden) oxidiert, inaktive Ni-B und eine kleine Menge von Ni-SI (die meisten oxidierten Zustand “aktiv”), die im Film als vorbereitet Hyd1 vorhanden war. Diese sind durch “aktive” Zustände des Hyd1 ersetzt; NI-C beobachtet Ni-R und Ni-L. beachten Sie, dass es zwei Formen der Ni-R und Ni-L Staaten, gibt wie die zwei νCO Bands belegt für diese Arten in Abbildung 4. Die Beobachtung der mehrere Ni-R und Ni-L Staaten ist im Einvernehmen mit anderen NiFe-Hydrogenasen. 48 , 58 , 59 Eine wichtige Prüfung der PFIRE-Methode ist, dass die zyklischen Voltammograms der Hyd1 innerhalb der Spectroelectrochemical Fluss Zelle zeigen aufgezeichnet ähnliche katalytische Wellenformen mit denen auf eine planare rotierende Scheibe Elektrode aufgenommen. 55 in der Praxis bedeutet dies, dass der Massentransport von Substrat (H2) und Produkt (H+) zu/von immobilisierten Hyd1 in der Spectroelectrochemical Zelle effizient auf die Durchflussmengen bei PFIRE Messungen verwendet. Die Wirkung der Volumenstrom auf die katalytische Wellenform wird in Abbildung 5dargestellt, zeigt nachfolgende Voltammograms H2 Atmosphäre (1 Bar) aufgenommen, da die Lösung Durchfluss durch die Spectroelectrochemical Zelle erhöht wird. In allen Fällen die Overpotential für H2 Oxidation durch Hyd1 ist identisch (rot schattiert Rechteck), aber das Ausmaß der oxidativen Inaktivierung (Hysterese zwischen den Strom während des oxidativen und reduktiven fegt auf Potentiale über ca 0 V Vs SCE) und die maximale H-2 -Oxidation, die aktuellen sind abhängig von der Durchflussmenge Lösung. Bei Strömungsgeschwindigkeiten über 52 mL/min (leichte graue Voltammogram) die katalytische Wellenform unempfindlich gegenüber weiter ist steigert Durchsatz. Abbildung 6 vergleicht die relativen Intensitäten der ν-CO-Band des Ni-B Staates nach Erstaktivierung und anaerobe Re-Oxidation bei 0 V Vs SCE (unter einer Ar-Atmosphäre, wie in 4.3 beschrieben) und anaeroben oxidativen Inaktivierung unter eine Ar-Atmosphäre bei 0 V Vs SCE nach 48 Stunden kontinuierliche Experimente (wie unter 5.1 beschrieben). Kein Verlust des aktiven Zentrums Band Intensität wird während der Messung beobachtet, und die Hyd1 Probe reagiert auf die angewandte Potenziale. Abbildung 7 zeigt die Grundlinie Korrekturverfahren während dieser Arbeit. Das absolute Spektrum der Hyd1 Probe in der aktiven Region (Abbildung 7ein) enthält deutliche Krümmung durch Wasser. In der Tat ist die Anforderung, Wasser als Lösungsmittel verwenden ein Problem für die meisten Anwendungen der IR-Spektroskopie in den Life Sciences. Die zweite Ableitung des absoluten Spektrums (Abb. 7b), berechnet mit Ursprung Software mit Savitsky-Golay Glättung über ein 9-Punkt-Fenster kann verwendet werden, um scharfe Bänder der Hyd1 aktiven Seite vor dem gebogenen Hintergrund zu identifizieren. Die Identifizierung der ungefähre Peak-Positionen mit einem zweiten Derivative Spektrum ermöglicht Grundlinie Ankerpunkte in Regionen des absoluten Spektrums platziert werden, die frei von aktiven Bands (Kreise in Abbildung 7ein). Eine kubische Spline-Funktion ist dann durch diese Ankerpunkte ausgestattet, um eine Basislinie Funktion erstellen, die dann abgezogen werden kann aus dem absoluten Spektrum um eine Grundlinie korrigiert Spektrum enthält nur Spitzen aus Hyd1 aktiven Seite (Abbildung 7 ( c). Abbildung 8 zeigt die Ergebnisse einer PFIRE Messung auf Hyd1, unter nicht-Umsatz (Ar-Atmosphäre) und Umsatz (H2 Atmosphäre) Bedingungen bei einer Reihe von Potentialen. 36 die aktuelle Zeit Spuren (Abbildung 8eine) Bericht über die katalytische Strom bei jedem angewendet Potenzial und bleiben bei nahe Null Strom-Umsatz Bedingungen (Ar-Atmosphäre). Die partielle Spectroelectrochemical Redox-Titration in Abbildung 8b berichtet daher über das Gleichgewicht Redox Verhalten der aktiven Seite, zeigt die Verteilung der Staaten, die auf jedes Potential in der Abwesenheit von katalytischen Umsatz erwartet. Die Spektren in Abbildung 8c Umsatz Bedingungen (unter einer H-2 -Atmosphäre) aufgenommen wurden und daher repräsentieren die stationäre Verteilung der aktiven Seite Staaten während katalytische Oxidation der H-2 durch Hyd1 vorhanden. Steady-State-Bedingungen erreicht worden ist durch die Tatsache bestätigt, dass die katalytische H2 Oxidation aktuelle (Abbildung 8ein, H2) als Funktion der Zeit bei −0.199 V und −0.074 V Vs SHE konstant bleibt; die monotonen Zerfall in Strom am +0.356 V Vs sie aufgrund der bekannten anaeroben oxidativen Inaktivierung von Hyd1 ist. 55 die Verteilung der aktiven Seite Staaten unterscheidet sich klar unter Ar und H2 auf alle Potentiale wo führt Hyd1 Katalyse (Abbildung 8b, Spektren bei −0.199, −0.074 und +0.356 V Vs SHE). Die Spektren aufgezeichnet unter Ar und H2 sind nahezu identisch bei −0.594 V Vs SHE, und dies ist einen wichtigen Test der experimentellen Konsistenz; Hyd1 verringert nicht H+ mit einer bedeutenden Rate bei pH 6.0 (der Strom in Abbildung 8eine unter Ar und H2 ist nahe Null), und die Spektren auf −0.594 V dürften deshalb identisch sein. Abbildung 9 zeigt die anaerobe oxidative Inaktivierung der Hyd1 über die Bildung von Ni-B aus Ni-SI bei H2 Oxidation bei +0.356 V.36 Spektren während die graue Zeitintervalle vermerkt die Strom-Zeit-Ablaufverfolgung aufgezeichnet wurden in Abbildung 9ein. −0.074 V Hyd1 oxidativen Inaktivierung nicht unterziehen und die Verteilung der aktiven Seite Staaten bleibt während der gesamten möglichen Schritt konstant. Das beweist die Spektren in Abbildung 9bich, die absolute Basis-korrigierten Spektrum zu Beginn der −0.074 möglichen Schritt und Abbildung 9bIi , die zu einem späteren Zeitpunkt aufgenommen wurde, berichtet Zeit während der möglichen Schritt und wird als ein Spektrum der Unterschied im Vergleich zu Abbildung 9bichgemeldet. Die Spektren in Abbildung 9bIii und biv sind auch als Unterschied Spektren im Vergleich zu Abbildung 9 bichgemeldet, und zeigen die allmähliche Umwandlung des Ni-SI Ni-b bei hohen Potenzial Inaktivierung, Einklang mit der monotonen Rückgang der Strom am +0.356 V in Abbildung 9ein. Spektren aufgenommen bei einer Lösung pH-Bereich geben Einblick in den Protonentransfer Schritte während der Hyd1 katalytischen Zyklus. 43 Abbildung 10 eine zeigt PFIRE Spektren aufgezeichnet auf dem gleichen Hyd1 Film bei pH 3,0 und pH 9.0, mit Lösungsfluss in der Spectroelectrochemical Zelle, die experimentelle Puffer auszutauschen. Die relativen Konzentrationen der Ni-C und Ni-L Staaten unterscheiden sich deutlich in diese beiden Spektren. Durch Variation der angewandten Potenzial-Umsatz Bedingungen erklärt die mögliche Abhängigkeit von NiC und Ni-L kann schnell ermittelt werden, bei einer Reihe von pH-Werten (Abb. 10b), und beide Staaten sind Isopotential über einen weiten pH-Bereich zu finden. (Beachten Sie, dass die Peak-Absorptionswerte in Abbildung 10b nur die Ni-C und Ni-L Staaten aus Gründen der Übersichtlichkeit, volle Redox berichteten Titrationen von Hyd1 von Hidalgo Et Al.) 36 eine pH-Wert-Titrierung der Konzentrationen von Ni-C und Ni-L kann dann extrahiert werden nimmt die Peak-Absorption auf Potentiale wo die Gesamtkonzentration Ni-C und Ni-L ihr Maximum bei jedem pH-Wert (Abbildung 10c). Auf diese Weise und in Verbindung mit EPR-Daten wurde ein pH-Gleichgewicht zwischen Ni-C und Ni-L Staaten identifiziert. 43 Abbildung 1: Schematische Darstellung der Anordnung der anaeroben Glovebox, ATR-Zubehör, IR-Spektrometer, MCT-Detektor, gas-Flow-System und verwendet für PFIRE Messungen Potentiostaten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Schematische Darstellung der Spectroelectrochemical Zelle für PFIRE Messungen, zeigt die Anordnung der Elektroden und Lösung Einlass/Auslass-Verbindungen verwendet. Die Zelle und die Bodenplatte sind aus Polyether-Ether-Keton (PEEK), mit Schraublöchern für ein Kohlestab arbeiten Elektrode Verbindung, Pt-Draht Gegenelektrode, gesättigt Kalomel Bezugselektrode und Lösung Einlass und Auslass bearbeitet. Die gesättigt Kalomel Referenz-Elektrode Bau wird als zuvor gemeldet. 36 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Absorptionsspektrum der Hyd1 veränderten Ruß Partikel, auf den Zorn gelegt und mit Puffer rehydriert. Die Positionen der Amid, die ich band, Amid II Band und Hyd1 aktive Region werden angezeigt, zusammen mit zusätzlichen Funktionen durch C-H Dehnung Vibrationen und Lösungsmittel Wasser. Der Inset zeigt eine vergrößerte Darstellung der aktiven Region, mit den VCO VCN Bändern und beschriftet. “Als bereit” Partikel enthalten Hyd1 hauptsächlich im oxidierten, inaktive Ni-B Zustand. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Aktivierung des Hyd1 bei −0.8 V Vs SCE unter einer H-2 -Atmosphäre, als reduzierte minus oxidierte Unterschied Spektrum vorgestellt. Bei niedrigen potenziellen Aktivierung oxidiert wandelt inaktiv Ni-B (und eine geringe Konzentration von Ni-SI) mehr reduziert, aktive Staaten Ni-C, Ni-R und Ni-L. beachten Sie, dass Hyd1 zwei unterschiedliche Unterzustände Ni-L und Ni-R. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 : Die Wirkung der Lösung Volumenstrom auf die Wellenform der katalytischen zyklische Voltammograms aufgezeichnet in der Zelle Spectroelectrochemical. Voltammograms verzeichneten bei Erhöhung der Fördermengen von H2-Puffer gesättigt, wie angegeben. Bei einer Durchflussmenge von 20 mL/min (rot) zeigt die Voltammogram erhebliche Inaktivierung über 0 V Vs SHE auf dem vorderen Scan. Bei Strömungsgeschwindigkeiten über 52 mL/min ist das Ausmaß der Inaktivierung wesentlich geringeren und des Stroms unabhängig vom Volumenstrom bei alle Potentiale. Weitere Parameter: 1 bar H2, 10 mV/s Abtastrate. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6 : Baseline korrigiert IR-Spektren in der aktiven Seite νCO Region oxidiert, inaktive Ni-B-Status bei 0 V Vs SCE. Gibt es keine messbaren Verlust des aktiven Zentrums Intensität während 48 Stunden kontinuierlicher PFIRE Messungen, und daher Hyd1 wird kräftig auf den Ruß-Partikeln adsorbiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7: Details der Grundlinie Korrekturverfahren für Datenhandling. Grundlinie Ankerpunkte befinden sich auf der absoluten Absorptionsspektrum im aktiven Bereich (ein), kümmert sich um jede νCO und νCN Gipfeln gekennzeichnet von einer zweiten Derivative Analyse (b) zu vermeiden. (C) zeigt die resultierende Grundlinie korrigierte Spektrum. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 8: PFIRE Messungen auf Hyd1 unter nicht-Umsatz (Ar) und Umsatz (H2) Bedingungen. (ein) aktuelle Zeit Spuren von Hyd1 in der Spectroelectrochemical-Zelle in Ar-gesättigten (grau) und H2-gesättigten (schwarz) Puffer; (b), (c) PFIRE Spektren zeigen die νCO Region jedes Potential unter Ar (b) und H2 (c). Potentiale zitiert in V Vs sie. Reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Hidalgo Et al. 35 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 9: Anaeroben Inaktivierung von Hyd1 über Bildung von Ni-B aus Ni-SI. (ein) Strom-Zeit-Spur H2 Atmosphäre, zeigt eine stabile elektrokatalytische zurzeit −0.074 V und langsam anaeroben Inaktivierung (monotone Abnahme der Strom) auf +0.356 V Vs SHE. (b) Spektren aufgenommen während der grauen schattierten Bereiche markiert (a). Spektrum bich ist Grundlinie korrigierte Spektrum am Anfang des −0.074 V potenzielle Schrittes aufgezeichnet. Spektrum bIi, zu einem späteren Zeitpunkt während der −0.074-V-Schritt aufgezeichnet wird als Unterschied Spektrum im Vergleich zu bich berichtet und zeigt, dass keine Änderung in der Verteilung der aktiven Seite Staaten stattfindet, konsistent mit der Stabilität der das Potential an −0.074 V. Spektren bIii und biv sind auch als Unterschied Spektren im Verhältnis zu bich gemeldet und zeigen schrittweise Umwandlung des Ni-SI Ni-b bei der anaeroben Inaktivierung bei +0.356 V Vs SHE. Reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Hidalgo Et al. 35 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 10 : Spektren aufgenommen bei einer Lösung pH-Bereich geben Einblick in den Protonentransfer Schritte während des katalytischen Zyklus Hyd1. (ein) IR Spektren zeigen der ν-CO -Region von Hyd1, bei pH 3,0 (-54 mV Vs SHE) und pH 9.0 (-334 mV Vs SHE) aufgezeichnet. (b) Spectroelectrochemical Titrationen wurden durchgeführt, um das Potenzial bestimmen, an dem die Ni-C und Ni-L Konzentrationen an höchstens bei einer Reihe von Lösung pH Werte. Nur die Ni-C und Ni-L-Konzentrationen sind aus Gründen der Übersichtlichkeit, für eine vollständige Spectroelectrochemical Titration von Hyd1 siehe Hidalgo Et Al. gezeigt. 36 (c) pH-Abhängigkeit der relativen Konzentration von Ni-C und Ni-L, wie aus einer Reihe von Experimenten wie in (b) ermittelt. Spektren wurden bei 20 ° C. Adaptiert mit Erlaubnis von Murphy Et al. 42 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

PFIRE ist ein breit anwendbar IR spektroskopischen Verfahren für den Umgang mit Redox-Elektrode immobilisierten Proteine. Insbesondere können elektrokatalytische Reaktionen der Redox-Enzyme schnell Umsatz Bedingungen sondiert werden. Die PFIRE-Methode baut auf der direkten elektrochemischen Kontrolle durch die Technik der PFE, die keine direkten strukturellen informiert, und IR-Spektroskopie an eine Kohlenstoffelektrode Paare zur Verfügung gestellt. Der PFIRE Ansatz so fügt chemische Einblick zu den verfügbaren Informationen von Elektrochemie allein und ist besonders geeignet um zu studieren in niedermolekularer Bindung und Aktivierung von Redox-Proteinen und Enzymen beteiligt. Darüber hinaus kann PFIRE über Potenzial-abhängige strukturelle Veränderungen in den Proteinen in der Abwesenheit von katalytischen Umsatz informieren. Solche nicht Umsatz Electron Transfer Ereignisse sind oft schwer zu erkennen, mit Standardanwendungen der PFE, obwohl die Ausweitung von PFE auf Fourier-transformierten AC Voltammetrie mit großem Erfolg. verwendet worden ist 45 , 46

Die PFIRE-Methode ist prinzipiell geeignet für die Untersuchung Redox-Protein, das mit PFE untersucht werden können. Daher wie bei PFE, ist Protein Adsorption ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche PFIRE-Experiment. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Anwendung der PFIRE-Technik mit E. Coli Hyd1 als eine Fallstudie. 36 , 43 jedoch haben wir auch die PFIRE Technik der zytoplasmatischen regulatorischen Hydrogenase von R. Eutropha,44 und Flavin Mononukleotid adsorbiert an Ruß angewendet. 40 in all diesen Fällen bietet einfache physikalische Adsorption, unverändert hohe Fläche Ruß (wie in diesem Protokoll beschrieben) eine Flächendeckung von Protein, das hoch genug, um gute Aufnahmequalität IR Spektren mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis ist. In Fällen, wo solche hohe Werte bei der Adsorption erreicht werden kann, kann es erforderlich sein, die Oberfläche der Kohlenstoffpartikel, zum Beispiel erlauben kovalente Bindung des Proteins an der Elektrodenoberfläche zu ändern sein. 60 , 61 , 62 die Verwendung einer Glovebox für PFIRE Messungen ist nur unbedingt erforderlich, bei der Untersuchung von Proben, die anaerob behandelt werden müssen. Aber in der Praxis sehr konstant und niedrig (< 80 ° C Taupunkt) Ebenen von Wasserdampf zur Verfügung gestellt von der Glovebox Atmosphäre geben Sie hohen Signal-Rausch-Ebenen, die die Gewinnung von sehr kleinen Absorptionswerte ermöglichen. 44 in vielen Fällen ist eine anaerobe Umgebung wie durch das Handschuhfach auch wünschenswert, dass die elektrochemische Messung (integraler Bestandteil der PFIRE-Technik) zur Vermeidung von aktuellen wegen O2 -Reduktion an der Arbeitselektrode.

IR Absorptionswerte durch Masse Wasser, experimentelle Puffer und die Kohlenstoffpartikel, auf denen die Probe adsorbiert, alle tragen wesentlich zu den experimentellen Spektren und Bands überschneiden könnten Interesse, vor allem in der Amid I, II und III Regionen der Spektrum. 63 die Amid-Region enthält auch Informationen von biologischen Arten wie Flavinen oder Nicotinamid Cofaktoren, sowie der Substrate und Produkte viele Reaktionen für Oxidation und Reduktion. Im Falle von NiFe Hydrogenasen νCO und νCN Bands der aktiven Seite fallen in einer relativ klaren Region des Spektrums und so die PFIRE-Technik eignet sich sehr gut auf das Studium dieser Enzyme. In anderen Fällen können Unterschied Spektren gepaart mit Isotopen Kennzeichnung Ansätze mussten jedoch werden Änderungen durch das immobilisierte Protein zu isolieren. Ähnliche Ansätze haben zu identifizieren, z. B. Protonierung Änderungen, strukturelle Umstellungen und Michaelis-Menten-komplexe mit IR-Spektroskopie zu studieren. 64 , 65 , 66 PFIRE, daher beschränkt sich auf das Studium der Hydrogenasen jedoch nicht auf jede Redox-Protein enthält (oder deren Substrate, Produkte oder Inhibitoren enthalten) angewendet werden können Gruppen mit diagnostischen IR-aktive Vibrationen; Kohlenmonoxid-Dehydrogeanses, Nitrogenases67 ,68,14 Flavoproteine,40 und Formiat Dehydrogenases, zum Beispiel.

Die damit verbundene Technik, SEIRA, eignet sich sehr gut für die Untersuchung von membranassoziierten Proteine in einer biomimetischen Umgebung. 32 SEIRA ist eine Adaption der IR-Spektroskopie, die auch eine ATR-IR-Konfiguration verwendet und nutzt eine Oberfläche Enhancement-Effekt, der die IR-Absorption von Molekülen liegt nahe (wenige nm) verstärkt die Oberfläche des Prismas ATR (IRE). SEIRA ist daher vorzüglich empfindlich auf spektrale Veränderungen, die auftreten innerhalb der adsorbierten Protein und Membran-Architektur und ist relativ frei von konkurrierenden Signale von Lösungsmittel und Substrate/Inhibitoren in Lösung. Dies ist etwas anders als die hier beschriebene PFIRE Technik stützt sich auf eine deutlich größere Eindringtiefe über der Oberfläche des IRE (~ 1 µm), was bedeutet, dass PFIRE empfindlicher auf Substrate, Produkte oder Inhibitoren in Lösung präsentieren. Diese erhöhte Empfindlichkeit gegenüber “Massen” Lösungsmittel kann von Vorteil sein; Wenn das Substrat oder das Produkt direkt von IR beobachtet werden kann, Berichten beide Steady-State-Kinetik der langlebigen aktiven Spezies und damit verbundenen Produktbildung während Electrocatalysis PFIRE Spektren. 69 die Möglichkeit zu beobachten, Steady-State-Konzentration von Substrat und Produkt werden besonders wertvoll für Enzyme wie Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (die katalysiert die reversible Oxidation von CO, CO2, eine starke IR-Absorber) oder Formiat-Dehydrogenase (die katalysiert die reversible Oxidation von Formiat CO2).

PFIRE beschränkt sich derzeit auf stationären kinetische Untersuchungen des Enzyms Electrocatalysis aufgrund der makroskopischen Kohleelektroden verwendet, um “das Enzym auf die Oberfläche ein IRE für Datenerhebung und ATR-IR Geometrie konzentrieren”. In dieser Hinsicht sind PFIRE Studien der NiFe-Hydrogenasen ergänzen die Arbeit der Dyer und Mitarbeiter,49,50 , die mit Licht ausgelöste vorübergehende Aufnahme IR-Spektroskopie um Sub Umsatz Kinetik zu studieren. Die Spectroelectrochemical Zelle,40 Miniaturisierung wird gearbeitet und mit dem Einsatz von Mikroelektroden zeitliche Auflösung in der Größenordnung von Mikrosekunden erreichbar sein sollte. Dies ermöglicht Studium der Sub-Umsatz Kinetik für Enzyme mit Umsatz-Frequenzen bis zu ca 100-500 s-1und das Studium der reduktiven und oxidative Prozesse ermöglichen.

Insgesamt ist PFIRE eine spektroskopische Technik, die chemische Charakterisierung elektrokatalytische Reaktionen der Redox-Enzyme unter Steady-State-Bedingungen ermöglicht. Der PFIRE Ansatz ermöglicht mehrere chemische und elektrochemische Titrationen derselben Enzym-Probe durchgeführt werden, da die große Oberfläche Elektroden verwendet, eine robuste Adsorption von Protein bieten und die ATR-IR-Geometrie einfache Lösung Austausch ermöglicht. Die Fähigkeit, solche Strukturinformationen in Situ während Enzymfunktion sammeln ist ein unschätzbares Werkzeug für die Bioelectrochemistry Gemeinschaft.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit des K.A.V. und P.A.A. wurde vom European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), Engineering and Physical Sciences Research Council IB Catalyst Award EP/N013514/1, und Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research unterstützt. Rat (BB/L009722/1 und BB/N006321/1). R.h. wurde unterstützt vom Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, und Lincoln College, Oxford. Die Autoren erkennen Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans und Mitarbeiter der mechanischen Werkstatt (Chemie) für die Unterstützung bei der Entwicklung und Herstellung von Spectroelectrochemical Zellen, die in dieser Arbeit verwendet.

Materials

Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ash, P. A., Vincent, K. A. Spectroscopic analysis of immobilised redox enzymes under direct electrochemical control. Chem. Commun. 48 (10), 1400-1409 (2012).
  2. Sezer, M., Millo, D., Weidinger, I. M., Zebger, I., Hildebrandt, P. Analyzing the catalytic processes of immobilized redox enzymes by vibrational spectroscopies. IUBMB Life. 64 (6), 455-464 (2012).
  3. Melin, F., Hellwig, P. Recent advances in the electrochemistry and spectroelectrochemistry of membrane proteins. Biol. Chem. 394 (5), 593-609 (2013).
  4. Dong, S., Niu, J., Cotton, T. M. Ultraviolet/visible spectroelectrochemistry of redox proteins. Methods Enzymol. 246, 701-732 (1995).
  5. Hellwig, P., et al. Electrochemical and Ultraviolet/Visible/Infrared Spectroscopic Analysis of Heme a and a3 Redox Reactions in the Cytochrome c Oxidase from Paracoccus denitrificans Separation of Heme a and a3 Contributions and Assignment of Vibrational Modes. Biochemistry. 38 (6), 1685-1694 (1999).
  6. Wu, S., et al. Redox chemistry of the Schizosaccharomyces pombe ferredoxin electron-transfer domain and influence of Cys to Ser substitutions. J. Inorg. Biochem. 105 (6), 806-811 (2011).
  7. Whitehouse, C. J. C., et al. A Highly Active Single-Mutation Variant of P450BM3 (CYP102A1). ChemBioChem. 10 (10), 1654-1656 (2009).
  8. Marritt, S. J., van Wonderen, J. H., Cheesman, M. R., Butt, J. N. Magnetic circular dichroism of hemoproteins with in situ control of electrochemical potential: “MOTTLE”. Anal. Biochem. 359 (1), 79-83 (2006).
  9. Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., Mäntele, W. Redox-linked conformational changes in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry. Eur. J. Biochem. 187 (3), 565-572 (1990).
  10. Iwaki, M., et al. Direct Observation of Redox-Linked Histidine Protonation Changes in the Iron-Sulfur Protein of the Cytochrome bc1 Complex by ATR-FTIR Spectroscopy. Biochemistry. 44 (11), 4230-4237 (2005).
  11. Marshall, D., et al. ATR-FTIR Redox Difference Spectroscopy of Yarrowia lipolytica and Bovine Complex I. Biochemistry. 45 (17), 5458-5467 (2006).
  12. Lacey, A. L. D., Gutiérrez-Sánchez, C., Fernández, V. M., Pacheco, I., Pereira, I. A. C. FTIR spectroelectrochemical characterization of the Ni-Fe-Se hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol. Inorg. Chem. 13 (8), 1315-1320 (2008).
  13. Millo, D., et al. Spectroelectrochemical Study of the [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in Solution and Immobilized on Biocompatible Gold Surfaces. J. Phys. Chem. B. 113 (46), 15344-15351 (2009).
  14. Paengnakorn, P., et al. Infrared spectroscopy of the nitrogenase MoFe protein under electrochemical control: potential-triggered CO binding. Chem. Sci. 8 (2), 1500-1505 (2017).
  15. Male, L., et al. Protein voltammetry and spectroscopy: integrating approaches. Theor. Chem. Acc. 119 (1-3), 107-111 (2008).
  16. Healy, A. J., Ash, P. A., Lenz, O., Vincent, K. A. Attenuated total reflectance infrared spectroelectrochemistry at a carbon particle electrode; unmediated redox control of a [NiFe]-hydrogenase solution. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (19), 7055-7059 (2013).
  17. Léger, C., Bertrand, P. Direct Electrochemistry of Redox Enzymes as a Tool for Mechanistic Studies. Chem. Rev. 108 (7), 2379-2438 (2008).
  18. Armstrong, F. A., Hirst, J. Reversibility and efficiency in electrocatalytic energy conversion and lessons from enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 14049-14054 (2011).
  19. Gates, A. J., et al. The relationship between redox enzyme activity and electrochemical potential-cellular and mechanistic implications from protein film electrochemistry. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (17), 7720-7731 (2011).
  20. Pershad, H. R., et al. Catalytic Electron Transport in Chromatium vinosum [NiFe]-Hydrogenase: Application of Voltammetry in Detecting Redox-Active Centers and Establishing That Hydrogen Oxidation Is Very Fast Even at Potentials Close to the Reversible H+/H2 Value. Biochemistry. 38 (28), 8992-8999 (1999).
  21. Goldet, G., et al. Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels and Active-Site Electronic/Redox Effects. J. Am. Chem. Soc. 131 (41), 14979-14989 (2009).
  22. Vincent, K. A., Parkin, A., Armstrong, F. A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. 107 (10), 4366-4413 (2007).
  23. Parkin, A., Seravalli, J., Vincent, K. A., Ragsdale, S. W., Armstrong, F. A. Rapid and Efficient Electrocatalytic CO2/CO Interconversions by Carboxydothermus hydrogenoformans CO Dehydrogenase I on an Electrode. J. Am. Chem. Soc. 129 (34), 10328-10329 (2007).
  24. van Wonderen, J. H., Burlat, B., Richardson, D. J., Cheesman, M. R., Butt, J. N. The Nitric Oxide Reductase Activity of Cytochrome c Nitrite Reductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 283 (15), 9587-9594 (2008).
  25. Schaming, D., et al. Spectroelectrochemical Characterization of Small Hemoproteins Adsorbed within Nanostructured Mesoporous ITO Electrodes. Langmuir. 28 (39), 14065-14072 (2012).
  26. Kemp, G. L., et al. Opportunities for mesoporous nanocrystalline SnO2 electrodes in kinetic and catalytic analyses of redox proteins. Biochem. Soc. Trans. 37 (2), 368-372 (2009).
  27. Renault, C., et al. Unraveling the Mechanism of Catalytic Reduction of O2 by Microperoxidase-11 Adsorbed within a Transparent 3D-Nanoporous ITO Film. J. Am. Chem. Soc. 134 (15), 6834-6845 (2012).
  28. Krzemiński, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Spectroelectrochemical Investigation of Intramolecular and Interfacial Electron-Transfer Rates Reveals Differences Between Nitrite Reductase at Rest and During Turnover. J. Am. Chem. Soc. 133 (38), 15085-15093 (2011).
  29. Akkilic, N., Kamran, M., Stan, R., Sanghamitra, N. J. M. Voltage-controlled fluorescence switching of a single redox protein. Biosens. Bioelectron. 67, 747-751 (2015).
  30. Ataka, K., Heberle, J. Electrochemically Induced Surface-Enhanced Infrared Difference Absorption (SEIDA) Spectroscopy of a Protein Monolayer. J. Am. Chem. Soc. 125 (17), 4986-4987 (2003).
  31. Millo, D., Hildebrandt, P., Pandelia, M. -. E., Lubitz, W., Zebger, I. SEIRA Spectroscopy of the Electrochemical Activation of an Immobilized [NiFe] Hydrogenase under Turnover and Non-Turnover Conditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2632-2634 (2011).
  32. Ataka, K., Stripp, S. T., Heberle, J. Surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) to probe monolayers of membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1828 (10), 2283-2293 (2013).
  33. Kozuch, J., et al. Voltage-dependent structural changes of the membrane-bound anion channel hVDAC1 probed by SEIRA and electrochemical impedance spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (20), 9546-9555 (2014).
  34. Silveira, C. M., et al. SERR Spectroelectrochemical Study of Cytochrome cd1 Nitrite Reductase Co-Immobilized with Physiological Redox Partner Cytochrome c552 on Biocompatible Metal Electrodes. PLoS One. 10 (6), 0129940 (2015).
  35. Todorovic, S., Hildebrandt, P., Martins, L. Surface enhanced resonance Raman detection of a catalytic intermediate of DyP-type peroxidase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17 (18), 11954-11957 (2015).
  36. Hidalgo, R., Ash, P. A., Healy, A. J., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy During Electrocatalytic Turnover Reveals the Ni-L Active Site State During H2 Oxidation by a NiFe Hydrogenase. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (24), 7110-7113 (2015).
  37. Grabarczyk, D. B., Ash, P. A., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Role of Dioxygen in the Nitrosylation Pathway of a [2Fe2S] Cluster Iron-Sulfur Protein. J. Am. Chem. Soc. 136 (32), 11236-11239 (2014).
  38. Kriegel, S., Uchida, T., Osawa, M., Friedrich, T., Hellwig, P. Biomimetic Environment to Study E. coli Complex I through Surface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy. Biochemistry. 53 (40), 6340-6347 (2014).
  39. El Khoury, Y., Van Wilderen, L. J. G. W., Bredenbeck, J. Ultrafast 2D-IR spectroelectrochemistry of flavin mononucleotide. J. Chem. Phys. 142 (21), 212416 (2015).
  40. Ash, P. A., et al. Synchrotron-Based Infrared Microanalysis of Biological Redox Processes under Electrochemical Control. Anal. Chem. 88 (13), 6666-6671 (2016).
  41. Nakamoto, K. . Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. Part B. , (2009).
  42. Bard, A., Faulkner, L. R. . Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. , (2001).
  43. Murphy, B. J., et al. Discovery of Dark pH-Dependent H+ Migration in a [NiFe]-Hydrogenase and Its Mechanistic Relevance: Mobilizing the Hydrido Ligand of the Ni-C Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 137 (26), 8484-8489 (2015).
  44. Ash, P. A., et al. Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O2 and CO. J. Phys. Chem. B. 119 (43), 13807-13815 (2015).
  45. Lee, C. -. Y., et al. Theoretical and experimental investigation of surface-confined two-center metalloproteins by large-amplitude Fourier transformed ac voltammetry. J. Electroanal. Chem. 656 (1-2), 293-303 (2011).
  46. Adamson, H., et al. Electrochemical evidence that pyranopterin redox chemistry controls the catalysis of YedY, a mononuclear Mo enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (47), 14506-14511 (2015).
  47. De Lacey, A. L., Fernández, V. M., Rousset, M., Cammack, R. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev. 107 (10), 4304-4330 (2007).
  48. Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., Reijerse, E. Hydrogenases. Chem Rev. 114 (8), 4081-4148 (2014).
  49. Greene, B. L., Wu, C. -. H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton-Coupled Electron Transfer Dynamics in the Catalytic Mechanism of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 137 (13), 4558-4566 (2015).
  50. Greene, B. L., Wu, C. -. H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton Inventory and Dynamics in the Nia-S to Nia-C Transition of a [NiFe] Hydrogenase. Biochemistry. 55 (12), 1813-1825 (2016).
  51. Greene, B. L., Vansuch, G. E., Wu, C. -. H., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Glutamate Gated Proton-Coupled Electron Transfer Activity of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 138 (39), 13013-13021 (2016).
  52. Sezer, M., et al. Role of the HoxZ Subunit in the Electron Transfer Pathway of the Membrane-Bound [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha Immobilized on Electrodes. J. Phys. Chem. B. 115 (34), 10368-10374 (2011).
  53. Heering, H. A., Wiertz, F. G. M., Dekker, C., de Vries, S. Direct Immobilization of Native Yeast Iso-1 Cytochrome c on Bare Gold: Fast Electron Relay to Redox Enzymes and Zeptomole Protein-Film Voltammetry. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 11103-11112 (2004).
  54. dos Santos, L., Climent, V., Blanford, C. F., Armstrong, F. A. Mechanistic studies of the “blue” Cu enzyme, bilirubin oxidase, as a highly efficient electrocatalyst for the oxygen reduction reaction. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (42), 13962-13974 (2010).
  55. Lukey, M. J., et al. How Escherichia coli Is Equipped to Oxidize Hydrogen under Different Redox Conditions. J. Biol. Chem. 285 (6), 3928-3938 (2010).
  56. Jones, A. K., et al. Enzyme Electrokinetics: Electrochemical Studies of the Anaerobic Interconversions between Active and Inactive States of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 125 (28), 8505-8514 (2003).
  57. Quinson, J., et al. Comparison of carbon materials as electrodes for enzyme electrocatalysis: hydrogenase as a case study. Faraday Trans. 172, 473-496 (2014).
  58. Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., Lubitz, W. [NiFe] hydrogenases: A common active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1827 (8-9), 986-1002 (2013).
  59. Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Proton transfer in the catalytic cycle of NiFe hydrogenases: insight from vibrational spectroscopy. ACS Catalysis. , (2017).
  60. Krishnan, S., Armstrong, F. A. Order-of-magnitude enhancement of an enzymatic hydrogen-air fuel cell based on pyrenyl carbon nanostructures. Chem. Sci. 3 (4), 1015-1023 (2012).
  61. Baffert, C., et al. Covalent Attachment of FeFe Hydrogenases to Carbon Electrodes for Direct Electron Transfer. Anal. Chem. 84 (18), 7999-8005 (2012).
  62. Rüdiger, O., et al. Enzymatic Anodes for Hydrogen Fuel Cells based on Covalent Attachment of Ni-Fe Hydrogenases and Direct Electron Transfer to SAM-Modified Gold Electrodes. Electroanal. 22 (7-8), 776-783 (2010).
  63. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell about proteins. Q. Rev. Biophys. 35 (4), 369-430 (2002).
  64. Jiang, X., et al. Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor by surface-enhanced IR difference spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (34), 12113-12117 (2008).
  65. Kottke, T., Lòrenz-Fonfrìa, V. A., Heberle, J. The Grateful Infrared: Sequential Protein Structural Changes Resolved by Infrared Difference Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 121 (2), 335-350 (2017).
  66. Callender, R., Dyer, R. B. The Dynamical Nature of Enzymatic Catalysis. Acc. Chem. Res. 48 (2), 407-413 (2015).
  67. Ciaccafava, A., et al. When the inhibitor tells more than the substrate: the cyanide-bound state of a carbon monoxide dehydrogenase. Chem. Sci. 7 (5), 3162-3171 (2016).
  68. George, S. J., Ashby, G. A., Wharton, C. W., Thorneley, R. N. F. Time-Resolved Binding of Carbon Monoxide to Nitrogenase Monitored by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 119 (27), 6450-6451 (1997).
  69. McPherson, I. J., Ash, P. A., Jacobs, R. M. J., Vincent, K. A. Formate adsorption on Pt nanoparticles during formic acid electro-oxidation: insights from in situ infrared spectroscopy. Chem Commun. 52 (85), 12665-12668 (2016).

Tags

Protein Film Infrared Electrochemistry[NiFe] HydrogenaseH2 OxidationRedox EnzymeBiophysicsBioelectrochemistryCarbon BlackBuffer ExchangeProtein AbsorptionPFIRE Measurements

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image