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Biochemistry

Proteina pellicola infrarossa elettrochimica ha dimostrato per lo studio di H2 ossidazione da un'idrogenasi [NiFe]

Published: December 04, 2017
doi:
10.3791/55858
, ,
1Department of Chemistry,University of Oxford, Inorganic Chemistry Laboratory

Summary

Qui, descriviamo una tecnica, elettrochimica a infrarossi pellicola della proteina, che permette di proteine redox immobilizzati da studiare spettroscopicamente sotto diretto controllo elettrochimico ad un elettrodo di carbonio. Spettri infrarossi di un campione della proteina singola possono essere registrati in una gamma di potenzialità applicate e in una varietà di condizioni di soluzione.

Abstract

Comprendere la chimica dei metodi di richieste di proteine redox che forniscono un controllo preciso redox centri all’interno della proteina. La tecnica di elettrochimica di pellicola di proteine, in cui una proteina è immobilizzata su una superficie di elettrodo tale che l’elettrodo sostituisce fisiologico elettroni donatori o accettori, ha fornito la comprensione funzionale nelle reazioni redox di una gamma di diversi proteine. Chimica completa comprensione richiede controllo elettrochimico di essere combinata con altre tecniche che possono aggiungere ulteriori indizi strutturali e meccanicistiche. Qui dimostriamo che una tecnica, elettrochimica a infrarossi pellicola proteica, che combina elettrochimica pellicola proteica con campionamento a infrarossi spettroscopica di proteine redox. La tecnica utilizza una geometria di riflettanza totale attenuata di multiplo-riflessione per sondare una proteina redox immobilizzata su un elettrodo di carbonio nero elevata area superficiale. Incorporazione di questo elettrodo in una cella di flusso permette di soluzione pH o le concentrazioni di soluto a essere cambiato durante le misurazioni. Questo è particolarmente efficace nell’affrontare enzimi redox, dove rapida fatturato catalitico può essere sostenuto e controllato all’elettrodo permettendo l’osservazione spettroscopica di specie longeva intermedio nel meccanismo catalitico. Dimostriamo la tecnica con esperimenti su Escherichia coli idrogenasi 1 in condizioni di non-fatturato e fatturato (ossidazione di2 H).

Introduction

Una sfida fondamentale nello studio della funzione della proteina comporta lo sviluppo di metodi in situ che permettono l’osservazione diretta delle proteine compiere loro ruoli fisiologici, in vivo o utilizzando isolato campioni della proteina. Ciò richiede l’integrazione di controllo o l’attivazione di processi in procedure sperimentali e l’uso di tecniche combinate che permettono sia la reattività da valutarsi e singoli passaggi chimici durante la funzione della proteina di misurare, contemporaneamente. Nel caso di proteine redox ciò equivale spesso a combinando tecniche elettrochimiche, che appunto controllano il potenziale applicato ma non forniscono nessuna informazione chimica diretta, con tecniche spettroscopiche che sono sensibili a specifiche chimicamente cambiamenti associati con la funzione della proteina. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry è un termine generale per una gamma di metodi elettrochimici e spettroscopiche accoppiati che comprendono una varietà di tecniche spettroscopiche e livelli di controllo elettrochimico. Molte proteine possono scambiare elettroni con artificiale, solubile elettroni donatori e accettori e ciò è stata sfruttata negli studi che utilizzano piccole molecole per mediare il trasferimento di elettroni, compreso l’accoppiamento con UV-visibile,4,5 , 6 , 7 dicroismo circolare magnetico8 e infrarossi5,9,10,11,12,13,14 (IR) spettroscopie. In un numero limitato di casi si è dimostrato possibile sfruttare scambio dell’elettrone senza mediazioni, diffusione controllata tra proteine ed elettrodi. 15 , 16

Per reazioni catalitiche effettuate da enzimi redox, soluzione elettrochimica approcci presenti un chiaro svantaggio. Diffusione controllata dell’elettrone trasferimento via redox mediatori in soluzione rischia di diventare tasso di limitazione. Cinetici e meccanicistici informazioni riguardo l’enzima possono essere perso, o almeno diventano difficili da deconvolute da manufatti di diffusione risultante dal metodo sperimentale. Controllo diretto e senza mediazioni elettrochimico è quindi uno strumento importante per lo studio di proteine redox ed enzimi. La tecnica di elettrochimica di proteina pellicola (PFE) utilizza proteine immobilizzate elettrodo redox, in modo tale che gli elettroni sono trasferiti direttamente da o verso i cofattori redox all’interno della proteina come l’elettrodo è polarizzata in una serie di potenziali. 17 , 18 , 19 PFE è di particolare valore per lo studio delle reazioni di ossidazione o riduzione catalizzata da enzimi redox, come trasferimento di elettroni interfacciale può essere realizzato a un tasso molto elevato. Ad esempio, il tasso di turnover elettrocatalitica dell’idrogenasi ([NiFe]) di ferro-nichel da Allochromatium vinosum è stato misurato da PFE come ca 1.000-10.000 s− 1 per ossidazione di2 H. 20 il potenziale di elettrodo funge da un trigger per attivare catalisi ‘on’ o ‘off’ e le relazioni corrente elettrocatalitica sull’attività enzimatica. PFE è quindi un metodo prezioso per analizzare la reattività degli enzimi complessi che dipendono strettamente dal potenziale, quali le reazioni del sito attivo di ferro di [FeFe]-idrogenasi con CO e O2,21 o indotta da potenziale reazioni di inattivazione dell’idrogenasi, monossido di carbonio deidrogenasi22 ,23 e altri enzimi complessi redox. 24

La principale barriera alla combinazione di tecniche spettroscopiche con il diretto controllo elettrochimico accordato dal PFE nasce dalla bassa copertura superficiale degli enzimi redox, nell’ordine di 1-2 pmol cm-2 per l’idrogenasi [NiFe] da a. vinosum, 20 relativo in situ studi di scienza delle superfici di adsorbati piccola molecola su elettrodi metallici alla rinfusa. Ciò rappresenta una sfida per la sensibilità della misura spettroscopica. Diversi metodi di Spettroelettrochimica sono stati segnalati per lo studio immobilizzato proteine redox a una gamma di diversi elettrodi: spettroscopia UV-visibile a elettrodi di ossido di metallo trasparente; 25 , 26 , spettroscopia di fluorescenza di 27 a elettrodi d’oro; 28 , superficie di 29 enhanced spettrometria di assorbimento dell’infrarosso (SEIRA) a elettrodi d’oro; 30 , 31 , 32 , 33 e superficie migliorate tecniche spettroscopiche Raman, principalmente a elettrodi d’argento. 34 , 35

Qui descriviamo un metodo per accoppiamento PFE con spettroscopia IR, in una tecnica conosciuta come elettrochimica di proteina pellicola infrarossa (PFIRE). 36 the PFIRE metodo studia enzimi redox immobilizzati su un elettrodo di lavoro elevata area superficiale carbonio in combinazione con una geometria di riflettanza totale attenuata IR (ATR-IR), sfruttando la facilità di adsorbimento di una gamma di proteine sulle superfici di carbonio. Spettroscopia IR è utile negli studi di enzimi redox e proteine come molte piccole molecole, ligandi e cofattori hanno assorbimenti diagnostici che possono essere utilizzati per valutare la reattività, associazione, inibizione e stato redox. Gli esempi includono associazione di NO ai centri ferro-zolfo, Studio37 di flavoproteine,38,39,40 piccola molecola vincolanti ai centri del heme ecc. 41 the ATR-IR geometria permette la costruzione di una cella elettrochimica di ottimizzato tre elettrodi (spectro)42 e pertanto fornisce un eccellente controllo elettrochimico. Soluzione resistenza e potenziale deriva sono minimizzati mettendo un elettrodo di riferimento vicino l’elettrodo di lavoro. Elevata superficie contatore gli elettrodi sono utilizzati che sono compatibili con correnti di alta elettrocatalitica prodotte da fatturato enzima veloce presso l’elettrodo di lavoro. Flusso di soluzione attraverso la cella di Spettroelettrochimica consente facile controllo la concentrazione di substrati, inibitori e pH. 36 , 43 , 44 il PFIRE metodo consente pertanto spettri IR essere registrato in situ durante elettrocatalisi enzima sostenuta. 36 , 44 PFIRE è anche in grado di fornire informazioni chimiche in assenza di corrente, catalitica43 contrariamente PFE dove può essere difficile per estrarre informazioni da processi non catalitico degli enzimi redox. 45 , 46

Abbiamo dimostrato il metodo PFIRE per lo studio di elettrocatalitica H2 ossidazione da [NiFe] idrogenasi, che contengono intrinseche ligandi CO e CN coordinate a Fe a un sito attivo bimetallico. 36 , 43 , 44 [NiFe] idrogenasi pertanto sono particolarmente adatti per lo studio di PFIRE. Il metodo PFIRE fornisce informazioni circa le specie che sono presenti durante il fatturato stazionario e pertanto fornisce informazioni cruciali oltre alla ricchezza della letteratura sulla spettroscopia IR di idrogenasi senza controllo sperimentale in fatturato. 47 , 48 Dyer e co-lavoratori sono impiegati metodi di IR risolta in tempo per lo studio di NiFe idrogenasi,49,50,51 utilizzando un trigger luce per applicare un piccolo passo di potenziale negativo (tramite uso di soluzione mediatori e una sorgente di elettroni ‘gabbia’) o fotolizzare un idruro associato. Anche se il metodo PFIRE non può, al momento, fornire risoluzione temporale per una partita di queste misurazioni,40 che consentono studio di processi catalitici sia riduttivi e ossidativi, letta in una gamma di potenzialità ben definito e gratis da trasporto di massa limitazioni.

Il metodo PFIRE è distinto dagli studi SEIRA di proteine redox, che anche utilizzano una geometria di ATR-IR e impiegano un elettrodo metallico su scala nanometrica-rugosa per migliorare la capacità di assorbimento IR di molecole adsorbite sulla superficie dell’elettrodo. 30 SEIRA è una tecnica estremamente preziosa per lo studio delle proteine di membrana, in particolare adsorbiti su o all’interno della membrana mimetica architetture,32 ma la necessità di un elettrodo di metallo possibile limitare l’ambito di substrati ed inibitori a causa della reattività del supporto elettrodo verso piccole molecole quali CO, CN–, CO2 ecc. Riduzione del protone e desorbimento monostrato auto-assemblato può essere problematici su superfici metalliche alle potenziali molto negativi,1,52 anche elettrodi di metallo enzima elettrocatalisi su non protetti è stata segnalata. 53 , 54 un svantaggio di PFIRE relativo SEIRA è la relativa difficoltà di integrare proteine di membrana nelle architetture di membrana nativa o mimetico. Tuttavia, la relativa inerzia chimica degli elettrodi di carbonio per reazioni di attivazione concorrenti piccola molecola rende PFIRE una tecnica eccellente per studiare l’enzima elettrocatalisi, in particolare nel settore basso potenziale rilevante per redox biologici processi quali la riduzione del protone di idrogenasi. 1 , 43

Lo scopo di questo articolo è quello di introdurre il metodo PFIRE come una tecnica per lo studio delle proteine immobilizzate elettrodo redox, utilizzando NiFe idrogenasi 1 (Hyd1) da Escherichia coli come esempio. Considerazioni di preparazione del campione, il requisito per il flusso buono substrato e gestione dei dati sono discusse. PFIRE è una tecnica ampiamente applicabile, ben adatta a studiare qualsiasi proteina redox (con caratteristici assorbimenti IR) che può essere adsorbita su elettrodi di carbonio, sia direttamente o mediante modificazione della superficie, tale che esso può scambiare elettroni con il elettrodo.

Protocol

1. ricreando il vano interno del campione di uno spettrometro FTIR all’interno di un Glovebox anaerobica, asciutto e requisiti generali sperimentali Utilizzare uno spettrometro FTIR commerciale dotato di un rilevatore di esterni mercurio cadmio telluride (MCT) e accessorio ATR. Purificare il corpo dello spettrometro con aria secca o dinitrogen, o in alternativa utilizzare uno spettrometro con un banco ottico evacuato. Posizionare lo spettrometro su un tavolo stabile, senza vibrazioni alla stessa altezza come un anaerobico (< 1 ppm O2), asciugare il vano portaoggetti (punto di rugiada <-75 ° C). Deviare il raggio IR dello spettrometro nel vano portaoggetti, attraverso una finestra trasparente di IR che è grande abbastanza per ospitare il fascio sfocato.Nota: È importante che lo spazio tra il cassetto portaoggetti e spettrometro è anche eliminato l’inceppo o evacuato, soprattutto se un materiale igroscopico finestra, come NaCl o KBr, ad esempio, viene utilizzato. Replicare il campione interno vano dello spettrometro all’interno del vano portaoggetti. Dirigere il raggio all’interno del vano portaoggetti su uno specchio ellissoidale fuori asse, idealmente con la stessa lunghezza focale come specchio di focalizzazione interna dello spettrometro.Nota: È utile avere due specchi di ulteriori piani inseriti prima di questo specchio di focalizzazione, al fine di consentire sia l’altezza e la direzione del fascio IR a essere regolata all’interno del vano portaoggetti; Questo compenserà qualsiasi inesattezza nel posizionamento iniziale dello spettrometro. Posizionare un esterno detector MCT, completa con un adatto messa a fuoco ottica (ad esempio una lunghezza focale corta ZnSe lente o specchio parabolico fuori asse, con una lunghezza focale corta) all’interno del vano portaoggetti, posizionati come replicare le dimensioni del campione interno scomparto dello spettrometro. Regolare il ‘focus’ del fascio IR per essere approssimativamente equidistante tra specchio di focalizzazione e il rilevatore MCT. Raffreddare il dewar del detector MCT esterno con azoto liquido. Montare l’accessorio ATR nel vano portaoggetti campione. Allineare l’input e l’output di messa a fuoco ottica e accessorio ATR per raggiungere la massima velocità di trasmissione al detector MCT. Se necessario, è possibile utilizzare un’apertura o altri attenuazione adatto (ad esempio una griglia di filo) per impedire la sovrasaturazione del segnale del rivelatore.Nota: per i dati presentati qui, un accessorio ATR cinque-riflessione con tutte le ottiche riflettenti e un rimovibile Si trapezoidale elemento di riflessione interna (IRE) viene utilizzato (Crystal GmbH, dimensioni ca 5 × 8 × 1 mm3, angolo della faccia 39,5 °). L’IRE è montata in una piastra di base smontabile in alluminio billet polietere etere chetone (PEEK). Usare un vano portaoggetti per il vano di campione ricreato con passacavi adatti per consentire la connessione a un potenziostato esternamente-ospitato (connessioni BNC strette di gas sono utili per questo scopo), accesso a gas e i cavi per trasferire il segnale da MCT rivelatore. È importante conservare qualsiasi schermatura del cavo rivelatore per evitare di introdurre rumore o interferenze per le misurazioni. Posto una pompa peristaltica, in grado di portate superiori a 60 mL/min all’interno del vano portaoggetti. Una vista schematica dello spettrometro, ATR accessorio, peristaltica pompa e potenziostato struttura è rappresentata in Figura 1. Costruire una cella Spettroelettrochimica, come quello rappresentato schematicamente nella Figura 2, che sigilla in ATR accessorio. La cella deve contenere un controelettrodo di elevata area superficiale (filo di Pt o garza), una connessione per l’elettrodo di lavoro (canna in carbonio) e un elettrodo di riferimento in miniatura. La cella deve contenere almeno due ulteriori porte come ingresso e uscita per scorrimento veloce delle soluzioni attraverso la cella.Nota: Un elettrodo di riferimento al calomelano saturo in miniatura è l’ideale per questo scopo. 36 2. preparazione di particelle di carbonio nero modificato con Escherichia coli idrogenasi 1 In un ‘umido’ guantiera anaerobica, mescolare 20 mg di elevata superficie particelle di nerofumo (> 1.000 m3/g) con 1 mL di acqua ad altissima purezza (resistività > MΩ 18cm) in un tubo del microcentrifuge. Disperdere le particelle di bassa potenza sonicazione (< 100 W) per almeno 15 minuti, o fino a quando la dispersione è uniforme e non non sedimenti entro 1 h, per dare una dispersione di nero di carbonio con un carico di circa 20 mg/mL. Prendere un’aliquota di e. coli idrogenasi 1 (Hyd1, circa 50 µ l, preparati secondo una procedura pubblicato55) ad una concentrazione di proteina ~ 7 mg/mL e cambiarlo in un buffer di forza ionica bassa ad un pH vicino al punto isoelettrico (per esempio fosfato di potassio, 15 mM, pH 5.8, senza ulteriori sale). Per ottenere migliori risultati, utilizzare una preparazione enzimatica che è il più attiva possibile. Eseguire lo scambio di buffer di concentrazione e diluizione, in un dispositivo di filtro centrifugo con un peso molecolare appropriato taglio (50 kDa funziona bene per Hyd1). Aggiungere il Hyd1 il dispositivo di filtro. Diluire con circa 450 µ l di tampone di scambio. Riconcentrarsi ad un volume di 50 µ l utilizzando una centrifuga delicata (< ~ 2700 × g) per impedire la precipitazione irreversibile. Ripetere i passaggi 2.2.2 e 2.2.3 buffer scambio è completo (in genere all’interno di ~ 5 cicli). Miscelare un volume di 5 µ l di 20 mg/mL dispersione di carbonio nero (preparato in 2.1) con l’aliquota di 50 µ l di tampone-scambiati Hyd1. Conservare la miscela di enzima-particella in frigorifero (a 0 ° C) durante la notte per consentire l’enzima di adsorbire. Può essere necessario agitare la miscela di tanto in tanto per garantire che le particelle restano dispersione. Lavare le particelle Hyd1-modificato con buffer di bassa forza ionica (fosfato di potassio, 15 mM, pH 5.8, senza ulteriori sale) di cicli successivi di sedimentazione e ri-dispersione in una microcentrifuga (~ 2.700 × g). Ripetere questo processo 3 – 5 volte per rimuovere enzima non adsorbito.Nota: Prima del primo lavaggio il surnatante dovrebbe essere praticamente incolore, che indica buon adsorbimento dell’enzima. Concentrare le particelle ad un volume finale di ~ 5 µ l, per dare un finale carico di ~ 20 mg/mL di particelle modificato dagli enzimi.Nota: Le particelle Hyd1-modificato possono essere memorizzate a 4 ° C fino a due settimane se rimangono idratati; Ciò si ottiene memorizzando particelle diluite con ~ 50 µ l di acqua ad altissima purezza. 3. preparazione per PFIRE misure su Escherichia coli idrogenasi 1 Pulire le IRE di Si di bassa potenza sonicazione (< 100 W), prima in H2così4 (< 90% w/w) per ~ 15 min e poi in HNO3 (70% w/w) per fino a 1 ora. Questa procedura di pulizia dovrebbe portare a una superficie idrofila IRE. Se è necessario pulire ulteriormente l’ira può essere messo in soluzione piranha (un rapporto di 1:3 di H2O2: H2SO4) per ossidare tutto il restante materiale organico.Nota: Metodi duri di pulizia acidi possono non essere adatti per l’uso con tutti i materiali di IRE. Soluzione piranha è altamente corrosivo e un forte ossidante, le superfici devono essere ragionevolmente pulite prima di uso di soluzione piranha e la cura dovrebbe essere presa durante la preparazione e uso di soluzione piranha a causa della natura esotermica del processo – sempre aggiungere H2O 2 lentamente di H2SO4 e fare riferimento alle procedure di sicurezza appropriate per preparazione, uso e smaltimento. Sciacquare le IRE pulita in acqua ad altissima purezza e asciugare sotto un flusso di gas di azoto secco. Eseguire Gestione di tutto il prisma utilizzando pinzette pulite per evitare la contaminazione. Sigillare le IRE in ATR accessorio piastra base utilizzando una sottile striscia di sigillante del silicone di grado elettrico. Fare attenzione a limitare il sigillante ai bordi della IRE. Consentire il sigillante asciugare completamente. Trasferire la piastra di base accessorio ATR al vano portaoggetti spettrometro e montarla sull’accessorio ATR. Misura di uno spettro di riferimento (sfondo) tra 4000-1.000 cm-1 risoluzione di 4 cm-1 , utilizzando il rapido standard scansione modalità dello spettrometro e 1024 interferogrammi media (~ 3-5 min di tempo di misura). Utilizzare questo spettro come input per consentire il calcolo degli spettri di assorbanza più tardi nell’esperimento.Nota: A causa dell’assorbanza piccolo previsto per il sito attivo Hyd1 è necessario raccogliere gli spettri con l’alto segnale ai rapporti di rumore. Trasferire la piastra di base accessorio ATR la guantiera “umida” che contiene la dispersione di particelle pre-preparati per volta Hyd1 (sezione 2). Goccia-cast un’aliquota di 1 µ l della dispersione delle particelle sul viso di grandi dimensioni di IRE e spargerli uniformemente su tutta la superficie. Nota: Non consentono le particelle di diventare completamente secco sulle IRE. Tagliare un pezzo di carta carbone, ad esempio quelli utilizzati come materiale di strato di diffusione di gas nelle celle a combustibile, a una dimensione ~0.1 mm inferiore le dimensioni della superficie di IRE (cioè ca. 8,2 × 4,9 mm2). L’area della superficie di carta carbone dovrebbe essere abbastanza grande da coprire le particelle di Hyd1-modificato di goccia-cast, ma non così grande da sovrapporre il sigillante del silicone utilizzato per fissare le IRE. Immergere la carta carbone in acqua e delicatamente posizionarlo sopra la parte superiore della pellicola della particella. Carta carbone fornirà un buon collegamento elettrico attraverso la pellicola intera particella.Nota: È utile preparare in anticipo diversi pezzi di carta carbone e memorizzarli pre-impregnati in acqua ad altissima purezza all’interno del vano portaoggetti anaerobico “umido”. Montare la cella Spettroelettrochimica (descritto in 1.7 e rappresentato schematicamente nella Figura 2) sopra le IRE, fissarlo nella piastra di base con viti. ~ 200 µ l di buffer sperimentale per mantenere l’enzima idratata. Un sistema misto tampone, in grado di buffer su un ampio intervallo di pH, è utile per gli studi su NiFe idrogenasi:56 acetato di sodio, 2-[N’-morpholino] etano-acidi solfonici (MES), N’-[2-idrossietil] piperazina -N’ -[2-etano-solfonico acido] (HEPES), N’-tris [idrossimetilico] metil-3-ammino-propano-solfonico acido (rubinetti) e 2-[N’-Cicloesilammino] etano-acidi solfonici (CHES), con ogni componente ad una concentrazione finale di 15 mM e contenente 0,1 M NaCl come elettrolita di supporto con pH regolato a pH 6 utilizzando concentrato NaOH e HCl.Nota: Il collegamento dell’elettrodo di lavoro deve sporgere leggermente sotto il piano della parte superiore della cella Spettroelettrochimica (~0.1 mm) per garantire il buon collegamento elettronico con la carta carbone (Figura 2). Collegare la soluzione ingresso e uscita della cella Spettroelettrochimica ad un sistema di flusso contenente il tubo della pompa peristaltica e una fiala del buffer sperimentale. Trasferire la cella assemblata la guantiera ‘a secco’ contenente lo spettrometro. Montare la cella Spettroelettrochimica sull’accessorio ATR. Connettersi il potenziostato, contatore e gli elettrodi di riferimento di lavoro. Collegare il tubo della pompa peristaltica alla pompa. Registrare uno spettro di assorbanza con interferogrammi 1024 in media risoluzione-1 4 cm sopra una gamma spettrale di 4.000-1.000 cm-1, utilizzando lo spettro raccolto in 3.4/sfondo di riferimento. A questo punto lo spettro dovrebbe contenere significativo (> 100 mO.D.) ammide II bande a ~ 1.540 cm-1 e bande di sito attivo di Hyd1 dovrebbero essere evidente nella regione spettrale 1.850-2.150 cm-1, in gran parte negli stati ossidati, inattivi (Figura 3 ). 4. attivazione di e. coli idrogenasi 1 e test la cella Spettroelettrochimica Applicare un riduzione potenziale (−0.8 V vs SCE) per il film di particella Hyd1-modificato. Saturare il buffer sperimentale con buffer di flusso e2 H lentamente attraverso la cella Spettroelettrochimica. Lasciare il campione durante la notte per attivare completamente il Hyd1.Nota: È importante utilizzare anaerobica H2, N2 ecc.e così tutti i gas anaerobici deve essere passata attraverso un filtro di2 O. Registrare uno spettro di assorbanza del campione dopo l’attivazione. Il νCO e vCN bande del sito attivo dovrebbero ora mostrare una distribuzione degli stati ridotti, ‘attivi’. Questo è più facilmente osservabile attraverso l’uso di uno spettro di differenza, rispetto lo spettro registrato in 3.10 (Figura 4). Verificare il collegamento elettrico della cella Spettroelettrochimica. Per effettuare questa operazione, saturare il buffer sperimentale con gas2 N. Applicare una sequenza di ossidanti (0 V vs SCE) e riducenti (−0.8 V vs SCE) potenziali (della durata di 30 min ca ) per il film di particella Hyd1-modificato e registrare uno spettro di assorbanza a ciascuno. Il Hyd1 dovrebbe diventare rapidamente ossidato e ridotto, e se il film di particella è ben collegato 100% del campione dovrebbe rispondere per il potenziale applicato. Impostare una portata appropriata del buffer sperimentale. Per effettuare questa operazione, applicare un riduzione potenziale (−0.8 V vs SCE) al campione e saturare il buffer sperimentale con H2. Registrare una serie di voltammograms ciclico tra-0.707 – 0.039 V vs SCE a una velocità di scansione di 10 mV/s. gradualmente aumentare il tasso di flusso di H2-saturi buffer tra voltammograms finché la forma d’onda catalitico che simile a una rotazione planare disco elettrodo55 e la corrente massima è indipendente della portata (Figura 5).Nota: Il limite di solubilità di H2 in acqua è ~0.8 mM a 293 K e 1 bar. Come il campione è pronto per le misure PFIRE, raccogliere gli spettri in una gamma di potenzialità, in una gamma di condizioni di soluzione (pH, temperatura, concentrazione di H2 ecc.). Registrare tutti i dati elettrochimici utilizzando il software potenziostato quanto è importante essere in grado di correlare dati spettroscopici ed elettrochimici, soprattutto quando si studia elettrocatalitica processi quali l’ossidazione di2 H di Hyd1. 5. trattamento spettroscopiche Confermare che il sito attivo non è stato definitivamente alterato nel corso delle misurazioni registrando spettri a 0 V e −0.8 V vs SCE alla fine dell’esperimento. Questi dovrebbero essere identici per gli spettri registrati al punto 4.3, e nessuna perdita di sito attivo dovrebbe essere osservata durante la misurazione (Figura 6). Spettri di assorbanza assoluto di esportazione dal software spettrometro in un formato adatto (con estensione CSV, ASCII, ‘matlab’, Jcamp ecc.) per l’elaborazione utilizzando software come origine o Matlab. Basale di correggere i dati, utilizzando il processo illustrato nella Figura 7. Prendere il secondo derivato di ogni spettro di assorbanza alla gamma 1.800-2.150 cm-1, al fine di individuare piccole (< 1 mO.D.) bande di sito attivo contro lo sfondo di acqua altamente curvo. Inserire punti di riferimento dell’indicatore sullo spettro di assorbanza originale e impostare i punti di ‘scatto’ allo spettro sperimentale. Forma una linea di base attraverso i punti utilizzando una funzione di interpolazione spline cubica o di una funzione polinomiale. Sottrarre questa funzione di base dai dati sperimentali.

Representative Results

La figura 1 Mostra una rappresentazione schematica della disposizione sperimentale del sistema a flusso spettrometro, cassetto portaoggetti, accessori ATR, potenziostato e gas utilizzato per le misurazioni di PFIRE. La figura 2 Mostra un rappresentante disegno della cella Spettroelettrochimica. La figura 3 Mostra gli spettri di assorbanza di goccia-cast per volta Hyd1 particelle, con il buffer sperimentale (un sistema tampone miste, descritto in 3,7, pH 6.0) che scorre attraverso la cella Spettroelettrochimica. La copertura della superficie di Hyd1 è particolarmente elevata nell’esempio mostrato in Figura 3, con un’intensità di banda ammide II di mO.D ~ 235. e minimal ‘massa’ acqua come testimoniano la grandezza della regione che si estende O-H (~ 3.000-3.600 cm-1) riguardante la band a ~ 1.640 cm-1, che è una convoluzione del ammide I banda di Hyd1 e l’ansa di acqua H-O-H. Bande supplementari a causa della proteina possono essere visto nella regione stretching C-H (ca 2900 cm-1). La banda larga centrata intorno a 2.100 cm-1 è una band di combinazione della vibrazione flettente H-O-H con una serie di bande basse di librazione di energia, che sono limitate rotazioni di H2O molecole a causa della rete di bonding dell’idrogeno in acqua liquida. La band diCO νdello stato ossidato, inattivo, Ni-B del sito attivo è chiaramente evidente a 1.943 cm-1, anche senza correzione della linea di base, e νCN caratteristiche sono chiaramente visibili tra 2.050-2.100 cm-1 . Alle alte Hyd1 riempimenti, gran parte della struttura microporosa di nero di carbonio pellicola57 diventa bloccato dall’enzima e quindi la concentrazione di acqua ‘massa’ è abbassata durante le misurazioni PFIRE. Gli spettri nella Figura 3 mostrano che, prima dell’attivazione, Hyd1 film contengono Hyd1 negli stati ossidati, inattivi. L’attivazione durante la notte a −0.8 V vs SCE sotto un’atmosfera di2 H porta alla formazione di ridotto, Stati cataliticamente attivi come illustrato in Figura 4 , che mostra uno spettro di differenza (ossidato) preparato come attivato (ridotta) meno di Hyd1. Spettri di differenza di Hyd1 possono essere interpretati in più chiaramente utilizzando il νCO regione. Ogni stato univoco del sito attivo ha solamente una banda di CO rispetto alle due fasce CN e pertanto la regioneCN νè intrinsecamente più complessa, con molte fasce sovrapposte. Lo spettro di differenza nella Figura 4 Mostra che l’attivazione porta alla perdita (bande di assorbimento negativo) di ossidato, inattivo Ni-B e una piccola quantità di Ni-SI (lo stato più ossidato ‘attivo’) che era presente nel film Hyd1 come preparato. Questi sono sostituiti da «attivi» stati di Hyd1; NI-C, Ni-R e Ni-L. nota che esistono due forme di Ni-R sia stati Ni-L, come testimoniano le bande diCO due νosservata per queste specie nella Figura 4. L’osservazione di più Stati Ni-R e Ni-L è in accordo con altri idrogenasi NiFe. 48 , 58 , 59 Un controllo delle chiavi del metodo PFIRE è che il voltammograms ciclico registrato di Hyd1 dentro lo spettacolo di cella di flusso Spettroelettrochimica waveshapes catalitica simile a quelli registrati su un elettrodo a disco rotante planare. 55 in pratica questo significa che il trasporto di massa del substrato (H2) e prodotto (H+) da/per Hyd1 immobilizzato nella cella Spettroelettrochimica è efficiente ai tassi di flusso utilizzati durante le misurazioni PFIRE. L’effetto della portata sulla forma d’onda catalitica è illustrato nella Figura 5, che illustra i successivi voltammograms registrato sotto un’atmosfera di2 H (1 bar), come il tasso di flusso di soluzione attraverso la cella di Spettroelettrochimica è aumentato. In tutti i casi il sovrapotenziale per ossidazione di2 H di Hyd1 è identico (rosso rettangolo ombreggiato), ma nella misura della inattivazione ossidativa (isteresi tra la corrente durante l’ossidativo e riduttiva spazza a potenziali sopra ca 0 V vs SCE) e l’ossidazione di2 H massima corrente dipendono dal tasso di flusso di soluzione. Alle portate sopra 52 mL/min (luce grigio voltammogram) la forma d’onda catalitica è insensibile a ulteriormente aumenta la portata. Figura 6 Confronta le intensità relative di νCO band dello stato Ni-B dopo l’attivazione iniziale e re-ossidazione anaerobica a 0 V vs SCE (sotto un’atmosfera di Ar, come descritto nel precedente paragrafo 4.3) e dopo inattivazione ossidativa anaerobica sotto un’atmosfera di Ar a 0 V vs SCE dopo 48 ore di continui esperimenti (come descritto in 5.1). Nessuna perdita di intensità di banda del sito attivo è osservata durante la misurazione, e tutti l’esempio di Hyd1 risponde ai potenziali applicati. Figura 7 illustra la procedura di correzione della linea di base utilizzata nel corso di questo lavoro. Lo spettro assoluto del campione Hyd1 nella regione del sito attivo (Figura 7a) contiene curvatura significativa a causa dell’acqua. Infatti, l’obbligo di usare acqua come solvente è un problema per la maggior parte delle applicazioni della spettroscopia IR nelle scienze della vita. La derivata seconda dello spettro assoluta (Figura 7b), calcolato utilizzando il software di origine con Savickij-Golay lisciando con una finestra di 9 punti, utilizzabile per identificare bande tagliente del sito attivo Hyd1 sullo sfondo curvo. L’identificazione delle posizioni di picco approssimativo utilizzando un secondo spettro derivato consente punti di ancoraggio della linea di base da inserire nelle regioni dello spettro assoluta che sono liberi di bande sito attivo (cerchi in Figura 7a). Una funzione spline cubica è poi montata attraverso questi punti di ancoraggio per creare una funzione di linea di base che possa poi essere sottratti dallo spettro assoluto per dare uno spettro corretto basale contenente soltanto i picchi derivanti dal sito attivo Hyd1 (Figura 7 c). Figura 8 Mostra i risultati di una misurazione PFIRE su Hyd1, sia fatturato (atmosfera di2 H) condizioni in una gamma di potenzialità e non-fatturato (atmosfera Ar). 36 la tracce di tempo corrente (Figura 8a) relazione sulla corrente catalitica ad ogni applicato potenziale e rimangono al vicino corrente zero in condizioni di non-fatturato (atmosfera Ar). La titolazione redox di parziale Spettroelettrochimica in Figura 8b di conseguenza segnala sul comportamento equilibrio redox del sito attivo, che mostra la distribuzione degli stati attesi per ogni potenziale in assenza di fatturato catalitico. Gli spettri in Figura 8c sono stati registrati in condizioni di fatturato (sotto un’atmosfera di2 H) e pertanto rappresentano la distribuzione allo steady-state del sito attivo stati presenti durante l’ossidazione catalitica di2 H di Hyd1. Che condizioni allo steady-state sono stati raggiunti è confermato dal fatto che l’H2 ossidazione catalitica corrente (Figura 8a, H2) rimane costante in funzione del tempo a −0.199 V e −0.074 V vs lei; il decadimento monotono in corrente a +0.356 V vs lei è dovuto l’inattivazione ossidativa anaerobica ben noto di Hyd1. 55 la distribuzione degli Stati di sito attivo è chiaramente differente sotto Ar e H2 a tutti i potenziali dove Hyd1 esegue catalisi (Figura 8b, spettri a −0.199, −0.074 e +0.356 V vs SHE). Gli spettri registrati sotto Ar e H2 sono praticamente identici alle −0.594 V vs lei, tuttavia, e questo rappresenta un importante test di consistenza sperimentale; Hyd1 non riduce H+ a una velocità significativa a pH 6.0 (l’attuale nella Figura 8una sotto Ar sia H2 è vicino a zero), e gli spettri a −0.594 V dovrebbero dunque essere lo stesso. Figura 9 dimostra l’inattivazione ossidativa anaerobica di Hyd1 tramite la formazione di Ni-B da Ni-SI durante l’ossidazione di2 H a +0.356 V.36 spettri sono stati registrati durante gli intervalli di tempo grigio notati sulla traccia del tempo corrente nella Figura 9una. Al −0.074 V Hyd1 non subisce inattivazione ossidativa e la distribuzione degli Stati di sito attivo è costante in tutto il passo intero potenziale. Questo è dimostrato dagli spettri in Figura 9bio, che segnala lo spettro della linea di base-rettificato assoluto all’inizio del passo potenziale −0.074 e Figura 9bii che è stato registrato in un secondo tempo durante la fase di potenziale e viene segnalato come uno spettro di differenza rispetto al Figura 9bio. Gli spettri in Figura 9biii e biv vengono anche segnalati come spettri di differenza rispetto al Figura 9bioe mostrano la graduale conversione Ni-SI Ni-b durante l’alta potenziale inattivazione, coerente con la diminuzione monotona in corrente mostrato a +0.356 V in Figura 9una. Spettri registrati a un intervallo di pH di soluzione dare spaccato il trasferimento di protone passaggi durante il Hyd1 catalitica del ciclo. 43 Figura 10 una Mostra PFIRE spettri registrati sulla stessa pellicola Hyd1 a pH 3.0 e pH 9.0, utilizzando il flusso di soluzione nella cella Spettroelettrochimica di scambiare il buffer sperimentale. Le concentrazioni relative di stati Ni-C e Ni-L sono chiaramente differenti in questi due spettri. Variando il potenziale applicato in condizioni di non-fatturato potenziale dipendenza del NiC e Ni-L dichiara può essere determinato rapidamente in una gamma di valori di pH (Figura 10b), ed entrambi gli Stati si trovano ad per essere isopotenziale sopra un ampio intervallo di pH. (Si noti che gli assorbimenti di picco in Figura 10b mostrano solo stati Ni-C e Ni-L per maggiore chiarezza, completo redox titolazioni di Hyd1 sono stati segnalati da Hidalgo et al.) 36 una titolazione pH delle concentrazioni di Ni-C e Ni-L possa allora essere estratte, prendendo l’assorbanza del picco a potenziali dove la concentrazione totale di Ni-C e Ni-L è al suo massimo a ogni pH (Figura 10c). In questo modo e in combinazione con dati di EPR, un equilibrio di pH tra Ni-C e Stati Ni-L è stato identificato. 43 Figura 1: Schema della disposizione di spettrometro IR, guantiera anaerobica, accessorio ATR, detector MCT, gas sistema di flusso e potenziostato utilizzato per misure di PFIRE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Diagramma schematico della cella Spettroelettrochimica utilizzata per misure PFIRE, mostrando la disposizione degli elettrodi e soluzione connessioni ingresso/uscita. La cella e la piastra di base sono lavorati da polietere etere chetone (PEEK), con fori per le viti di una canna di carbonio lavorando collegamento elettrodo, Pt controelettrodo di filo, elettrodo di riferimento al calomelano saturo e soluzione ingresso e uscita. La costruzione di elettrodo di riferimento al calomelano saturo è come precedentemente segnalata. 36 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: spettro di assorbimento di particelle di nerofumo Hyd1-modificato, depositati sulle IRE e reidratato con buffer. Le posizioni della ammide che banda, banda di ammide II e della regione sito attivo Hyd1 sono indicate, insieme a funzionalità aggiuntive a causa di vibrazioni stretching C-H e solvente acqua. L’inserto mostra una vista ingrandita della regione del sito attivo, con la vCO vCN bande e con l’etichetta. ‘Come-preparato’ particelle contengono Hyd1 principalmente nello stato Ni-B ossidato, inattivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Attivazione di Hyd1 a −0.8 V vs SCE sotto un’atmosfera di2 H, presentata come uno spettro ridotto meno differenza ossidato. Basso potenziale attivazione ossidato, inattivo Ni-B (e una piccola concentrazione di Ni-SI) si converte più ridotti, attivi stati Ni-C, Ni-R e Ni-L. nota che Hyd1 ha due distinti stati secondari di Ni-L e Ni-R. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : L’effetto della portata di soluzione sulla forma d’onda di voltammograms ciclico catalitico registrato nella cella Spettroelettrochimica. Voltammograms sono state registrate all’aumento dei tassi di flusso di H2-saturi buffer come indicato. Ad una portata di 20 mL/min (rosso) il voltammogram Mostra significativa inattivazione sopra 0 V vs lei la scansione in avanti. A velocità di flusso superiore a 52 mL/min nella misura di inattivazione è notevolmente più bassa e la corrente è indipendente della portata a tutti i potenziali. Altri parametri: 1 bar H2, 10 mV/s di velocità di scansione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Linea di base corretto spettri IR della regione di CO sito attivo νdi ossidato, inattivo stato Ni-B a 0 V vs SCE. Non ci è perdita misurabile del sito attivo intensità durante 48 ore di misurazioni continue PFIRE, e pertanto Hyd1 è adsorbito robustamente sulle particelle di carbonio nero. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Dettagli delle procedure di correzione della linea di base utilizzate per la gestione dati. Punti di ancoraggio della linea di base sono inseriti lo spettro di assorbanza assoluta nella regione sito attivo (un), avendo cura di evitare qualsiasi νCO e νCN picchi identificati da una seconda analisi derivata (b). Lo spettro di corretta previsione risultante è mostrato in (c). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Misure PFIRE su Hyd1 non-fatturato (Ar) e fatturato (H2) condizioni. (un) tempo corrente tracce di Hyd1 nella cella Spettroelettrochimica in Ar-saturi (grigio) e H2-saturi (nero) buffer; (b), (c) PFIRE spettri Mostra la regione diCO νogni potenziale sotto Ar (b) e H2 (c). I potenziali citato in V vs lei. Riprodotto con permesso da Hidalgo et al. 35 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9: Anaerobica inattivazione di Hyd1 tramite formazione di Ni-B da Ni-SI. (un) traccia di tempo corrente sotto un’atmosfera di2 H, mostrando un elettrocatalitica stabile corrente a −0.074 V e inattivazione lenta anaerobica (diminuzione monotona corrente) a +0.356 V vs lei. (b) spettri registrati durante le regioni ombreggiate grigie contrassegnate (a). Spettro bmi è uno spettro corretto basale registrato all’inizio del passaggio del potenziale di −0.074 V. Spettro bii, registrata in un secondo momento durante la fase di V −0.074, viene segnalato come uno spettro di differenza rispetto a bio e mostra che si verifica alcun cambiamento nella distribuzione degli Stati di sito attivo, coerente con la stabilità del potenziale presso −0.074 V. Spettri biii e biv vengono anche segnalati come spettri di differenza rispetto a bio e mostrare graduale conversione di Ni-SI Ni-B durante l’inattivazione anaerobico a +0.356 V vs lei. Riprodotto con permesso da Hidalgo et al. 35 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 10 : Spettri registrati a un intervallo di pH di soluzione dare spaccato il trasferimento di protone passi durante il ciclo catalitico Hyd1. (un) IR spectra Mostra la regioneCO νHyd1, registrato al pH 3.0 (-54 mV vs SHE) e pH 9.0 (-334 mV vs SHE). (b) Spettroelettrochimica titolazioni sono stati effettuati per determinare il potenziale in cui le concentrazioni di Ni-C e Ni-L sono al massimo a una gamma di valori di pH della soluzione. Vengono visualizzate solo le concentrazioni Ni-C e Ni-L per maggiore chiarezza, per una titolazione Spettroelettrochimica completo di Hyd1 Vedi Hidalgo et al. 36 (c) dipendenza dal pH della relativa concentrazione di Ni-C e Ni-L, come determinato da una serie di esperimenti come quelli mostrati in (b). Gli spettri sono stati registrati a 20 ° C. Adattato con permesso da Murphy et al. 42 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

PFIRE è una tecnica spettroscopica di IR ampiamente applicabile per l’indirizzamento proteine immobilizzate elettrodo redox. In particolare, possono essere sondate elettrocatalitica reazioni degli enzimi redox in condizioni di rapido turnover. Il metodo PFIRE si basa il controllo diretto di elettrochimico fornito dalla tecnica di PFE, non fornisce alcuna informazione strutturale diretta, o per coppie per spettroscopia IR ad un elettrodo di carbonio. L’approccio PFIRE così aggiunge insight chimica alle informazioni disponibili da elettrochimica da solo ed è molto adatto per lo studio di proteine redox ed enzimi coinvolti nella attivazione e sull’associazione di piccola molecola. Inoltre, PFIRE può fornire informazioni sulla potenziale-dipendente cambiamenti strutturali in proteine in assenza di fatturato catalitico. Tali eventi di trasferimento dell’elettrone non fatturato sono spesso difficili da rilevare l’utilizzo di applicazioni ‘standard’ di PFE, anche se l’estensione del PFE a trasformata di Fourier AC voltammetria è stato utilizzato con grande successo. 45 , 46

Il metodo PFIRE è, in linea di principio, adatto per lo studio di qualsiasi proteina redox che possa essere studiato utilizzando PFE. Pertanto, come con PFE, adsorbimento di proteine è un passo fondamentale per un esperimento riuscito di PFIRE. In questo protocollo Descriviamo un’applicazione della tecnica PFIRE utilizzando e. coli Hyd1 come caso di studio. 36 , 43 tuttavia, abbiamo anche applicato la tecnica PFIRE per il citoplasmico idrogenasi normativo da r. eutropha,44 e flavina mononucleotide adsorbito su nero di carbonio. 40 in tutti questi casi, semplice adsorbimento fisico al nerofumo non modificato ad alta area superficiale (come descritto in questo protocollo) fornisce una copertura della superficie della proteina che è abbastanza alta per spettri IR record di buona qualità con un elevato rapporto segnale-rumore. In casi dove non possono essere raggiunto livelli così elevati di adsorbimento può essere necessario modificare la superficie delle particelle di carbonio, ad esempio per consentire il collegamento covalente di proteine di superficie dell’elettrodo. 60 , 61 , 62 l’uso di un vano portaoggetti per misurazioni PFIRE è strettamente necessario solo quando lo studio di campioni che devono essere gestiti in condizioni aerobiche. Tuttavia in pratica estremamente costante e basso (punto di rugiada < 80 ° C) livelli di vapore acqueo fornito dall'atmosfera guantiera dare elevati livelli di segnale-rumore che consentono l'estrazione di assorbimenti molto piccoli. 44 in molti casi un ambiente anaerobico, come quello fornito da vano portaoggetti, è anche auspicabile per la misura elettrochimica (integrale alla tecnica PFIRE) al fine di evitare corrente a causa della riduzione di2 O presso l’elettrodo di lavoro.

Assorbimenti IR a causa della massa d’acqua, buffer sperimentale e le particelle di carbonio su cui il campione è adsorbito contribuiscono significativamente a spettri sperimentali e potrebbe si sovrappongono bande di interesse, in particolare dell’ammide I, regioni II e III della spettro. 63 la regione ammide contiene anche informazioni da specie organiche come Flavine o cofattori di nicotinammide, così come i substrati e prodotti di molte reazioni di ossidazione e riduzione. Nel caso di NiFe idrogenasi, bandeCN CO e ν νdel sito attivo rientrano in una regione relativamente chiara dello spettro e quindi la tecnica PFIRE è molto adatto per lo studio di questi enzimi. In altri casi, tuttavia, spettri di differenza accoppiati con approcci etichettatura isotopici possono essere necessario per isolare le modifiche a causa della proteina immobilizzata. Approcci simili sono stati utilizzati per identificare, ad esempio, i cambiamenti di protonazione, riorganizzazioni strutturali e per lo studio di complessi di Michaelis-Menten usando spettroscopia IR. 64 , 65 , 66 PFIRE non è dunque, limitato allo studio della idrogenasi ma può essere applicato a qualsiasi proteina redox che contiene (o cui substrati, prodotti o inibitori contengono) gruppi con diagnostiche vibrazioni IR-attivo; dehydrogeanses di monossido di carbonio, nitrogenases67 ,68,14 flavoproteine,40 e formiato deidrogenasi, per esempio.

La tecnica correlata, SEIRA, è molto adatto per lo studio delle proteine di membrana-collegato in un ambiente di biomimetici. 32 SEIRA è un adattamento della spettroscopia IR che inoltre utilizza una configurazione di ATR-IR e fa uso di un effetto di potenziamento superficie che amplifica l’assorbanza di IR di molecole che si trova vicino a (all’interno di pochi nm) la superficie del prisma ATR (IRE). SEIRA pertanto è squisitamente sensibile a cambiamenti spettrali che si verificano all’interno dell’architettura di membrana e proteine adsorbita ed sono relativamente libero da concorrenti segnali dal solvente e substrati/inibitori presenti in soluzione. Questo è un po’ in contrasto con la tecnica PFIRE descritta qui, che si basa su una profondità di penetrazione significativamente maggiore sopra la superficie dell’IRE (~ 1 µm), che significa che PFIRE è più sensibile ai substrati, prodotti o inibitori presentano in soluzione. Questa maggiore sensibilità alla ‘massa’ solvente può essere vantaggioso; Se il substrato o il prodotto può essere osservato direttamente da IR, spettri PFIRE riferire su entrambi cinetica allo stato stazionario di specie longeva attivo e formazione di prodotto associato durante elettrocatalisi. 69 la capacità di osservare concentrazioni allo steady state di substrato ed il prodotto sarà particolarmente preziosa per gli enzimi come monossido di carbonio deidrogenasi (che catalizza l’ossidazione reversibile di CO a CO2, un forte assorbitore IR) o deidrogenasi di formiato (che catalizza l’ossidazione reversibile di formiato di CO2).

Attualmente, PFIRE si limita agli studi cinetici allo steady-state di enzima elettrocatalisi dovuto gli elettrodi di carbonio macroscopica utilizzati per ‘concentrarsi’ l’enzima sulla superficie di una IRE per la geometria di ATR-IR e raccolta di dati in. A questo proposito sono complementari al lavoro di Dyer e colleghi di lavoro,49,50 che utilizzano luce-attivato transitoria spettroscopia IR per studiare la cinetica di Sub-fatturato PFIRE studi di NiFe idrogenasi. Si sta lavorando per miniaturizzare la cella Spettroelettrochimica,40 e con l’uso di microelettrodi risoluzione temporale dell’ordine di microsecondi dovrebbe essere realizzabile. Questo consentirà di studio della cinetica di Sub-fatturato per gli enzimi con frequenze di fatturato fino a ca 100-500 s-1e consentirà lo studio di processi riduttivi e di ossidazione.

Nel complesso, PFIRE è una tecnica spettroscopica che permette la caratterizzazione chimica delle reazioni elettrocatalitica di enzimi redox in condizioni di stato stazionario. L’approccio PFIRE consente molteplici titolazioni chimici ed elettrochimici essere effettuate sullo stesso campione di enzima, come gli elettrodi ad alta area superficiale usati forniscono un robusto adsorbimento di proteine e la geometria di ATR-IR permette lo scambio di facile soluzione. La capacità di raccogliere tali informazioni strutturali in situ durante la funzione degli enzimi è uno strumento prezioso per la più ampia comunità di Bioelettrochimica.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro di K.A.V e P.A.A. è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), Engineering and Physical Sciences Research Consiglio IB Catalyst Premio EP/N013514/1 e Biotechnology and Biological Sciences Research Consiglio (BB/L009722/1 e 1/N006321/BB). U.R. è stata sostenuta dal Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica e Lincoln College di Oxford. Gli autori riconoscono Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans e personale dell’officina meccanica (dipartimento di chimica) per l’assistenza nella progettazione e fabbricazione di cellule Spettroelettrochimica utilizzato in questo lavoro.

Materials

Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer
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References

  1. Ash, P. A., Vincent, K. A. Spectroscopic analysis of immobilised redox enzymes under direct electrochemical control. Chem. Commun. 48 (10), 1400-1409 (2012).
  2. Sezer, M., Millo, D., Weidinger, I. M., Zebger, I., Hildebrandt, P. Analyzing the catalytic processes of immobilized redox enzymes by vibrational spectroscopies. IUBMB Life. 64 (6), 455-464 (2012).
  3. Melin, F., Hellwig, P. Recent advances in the electrochemistry and spectroelectrochemistry of membrane proteins. Biol. Chem. 394 (5), 593-609 (2013).
  4. Dong, S., Niu, J., Cotton, T. M. Ultraviolet/visible spectroelectrochemistry of redox proteins. Methods Enzymol. 246, 701-732 (1995).
  5. Hellwig, P., et al. Electrochemical and Ultraviolet/Visible/Infrared Spectroscopic Analysis of Heme a and a3 Redox Reactions in the Cytochrome c Oxidase from Paracoccus denitrificans Separation of Heme a and a3 Contributions and Assignment of Vibrational Modes. Biochemistry. 38 (6), 1685-1694 (1999).
  6. Wu, S., et al. Redox chemistry of the Schizosaccharomyces pombe ferredoxin electron-transfer domain and influence of Cys to Ser substitutions. J. Inorg. Biochem. 105 (6), 806-811 (2011).
  7. Whitehouse, C. J. C., et al. A Highly Active Single-Mutation Variant of P450BM3 (CYP102A1). ChemBioChem. 10 (10), 1654-1656 (2009).
  8. Marritt, S. J., van Wonderen, J. H., Cheesman, M. R., Butt, J. N. Magnetic circular dichroism of hemoproteins with in situ control of electrochemical potential: “MOTTLE”. Anal. Biochem. 359 (1), 79-83 (2006).
  9. Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., Mäntele, W. Redox-linked conformational changes in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry. Eur. J. Biochem. 187 (3), 565-572 (1990).
  10. Iwaki, M., et al. Direct Observation of Redox-Linked Histidine Protonation Changes in the Iron-Sulfur Protein of the Cytochrome bc1 Complex by ATR-FTIR Spectroscopy. Biochemistry. 44 (11), 4230-4237 (2005).
  11. Marshall, D., et al. ATR-FTIR Redox Difference Spectroscopy of Yarrowia lipolytica and Bovine Complex I. Biochemistry. 45 (17), 5458-5467 (2006).
  12. Lacey, A. L. D., Gutiérrez-Sánchez, C., Fernández, V. M., Pacheco, I., Pereira, I. A. C. FTIR spectroelectrochemical characterization of the Ni-Fe-Se hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol. Inorg. Chem. 13 (8), 1315-1320 (2008).
  13. Millo, D., et al. Spectroelectrochemical Study of the [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in Solution and Immobilized on Biocompatible Gold Surfaces. J. Phys. Chem. B. 113 (46), 15344-15351 (2009).
  14. Paengnakorn, P., et al. Infrared spectroscopy of the nitrogenase MoFe protein under electrochemical control: potential-triggered CO binding. Chem. Sci. 8 (2), 1500-1505 (2017).
  15. Male, L., et al. Protein voltammetry and spectroscopy: integrating approaches. Theor. Chem. Acc. 119 (1-3), 107-111 (2008).
  16. Healy, A. J., Ash, P. A., Lenz, O., Vincent, K. A. Attenuated total reflectance infrared spectroelectrochemistry at a carbon particle electrode; unmediated redox control of a [NiFe]-hydrogenase solution. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (19), 7055-7059 (2013).
  17. Léger, C., Bertrand, P. Direct Electrochemistry of Redox Enzymes as a Tool for Mechanistic Studies. Chem. Rev. 108 (7), 2379-2438 (2008).
  18. Armstrong, F. A., Hirst, J. Reversibility and efficiency in electrocatalytic energy conversion and lessons from enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 14049-14054 (2011).
  19. Gates, A. J., et al. The relationship between redox enzyme activity and electrochemical potential-cellular and mechanistic implications from protein film electrochemistry. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (17), 7720-7731 (2011).
  20. Pershad, H. R., et al. Catalytic Electron Transport in Chromatium vinosum [NiFe]-Hydrogenase: Application of Voltammetry in Detecting Redox-Active Centers and Establishing That Hydrogen Oxidation Is Very Fast Even at Potentials Close to the Reversible H+/H2 Value. Biochemistry. 38 (28), 8992-8999 (1999).
  21. Goldet, G., et al. Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels and Active-Site Electronic/Redox Effects. J. Am. Chem. Soc. 131 (41), 14979-14989 (2009).
  22. Vincent, K. A., Parkin, A., Armstrong, F. A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. 107 (10), 4366-4413 (2007).
  23. Parkin, A., Seravalli, J., Vincent, K. A., Ragsdale, S. W., Armstrong, F. A. Rapid and Efficient Electrocatalytic CO2/CO Interconversions by Carboxydothermus hydrogenoformans CO Dehydrogenase I on an Electrode. J. Am. Chem. Soc. 129 (34), 10328-10329 (2007).
  24. van Wonderen, J. H., Burlat, B., Richardson, D. J., Cheesman, M. R., Butt, J. N. The Nitric Oxide Reductase Activity of Cytochrome c Nitrite Reductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 283 (15), 9587-9594 (2008).
  25. Schaming, D., et al. Spectroelectrochemical Characterization of Small Hemoproteins Adsorbed within Nanostructured Mesoporous ITO Electrodes. Langmuir. 28 (39), 14065-14072 (2012).
  26. Kemp, G. L., et al. Opportunities for mesoporous nanocrystalline SnO2 electrodes in kinetic and catalytic analyses of redox proteins. Biochem. Soc. Trans. 37 (2), 368-372 (2009).
  27. Renault, C., et al. Unraveling the Mechanism of Catalytic Reduction of O2 by Microperoxidase-11 Adsorbed within a Transparent 3D-Nanoporous ITO Film. J. Am. Chem. Soc. 134 (15), 6834-6845 (2012).
  28. Krzemiński, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Spectroelectrochemical Investigation of Intramolecular and Interfacial Electron-Transfer Rates Reveals Differences Between Nitrite Reductase at Rest and During Turnover. J. Am. Chem. Soc. 133 (38), 15085-15093 (2011).
  29. Akkilic, N., Kamran, M., Stan, R., Sanghamitra, N. J. M. Voltage-controlled fluorescence switching of a single redox protein. Biosens. Bioelectron. 67, 747-751 (2015).
  30. Ataka, K., Heberle, J. Electrochemically Induced Surface-Enhanced Infrared Difference Absorption (SEIDA) Spectroscopy of a Protein Monolayer. J. Am. Chem. Soc. 125 (17), 4986-4987 (2003).
  31. Millo, D., Hildebrandt, P., Pandelia, M. -. E., Lubitz, W., Zebger, I. SEIRA Spectroscopy of the Electrochemical Activation of an Immobilized [NiFe] Hydrogenase under Turnover and Non-Turnover Conditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2632-2634 (2011).
  32. Ataka, K., Stripp, S. T., Heberle, J. Surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) to probe monolayers of membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1828 (10), 2283-2293 (2013).
  33. Kozuch, J., et al. Voltage-dependent structural changes of the membrane-bound anion channel hVDAC1 probed by SEIRA and electrochemical impedance spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (20), 9546-9555 (2014).
  34. Silveira, C. M., et al. SERR Spectroelectrochemical Study of Cytochrome cd1 Nitrite Reductase Co-Immobilized with Physiological Redox Partner Cytochrome c552 on Biocompatible Metal Electrodes. PLoS One. 10 (6), 0129940 (2015).
  35. Todorovic, S., Hildebrandt, P., Martins, L. Surface enhanced resonance Raman detection of a catalytic intermediate of DyP-type peroxidase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17 (18), 11954-11957 (2015).
  36. Hidalgo, R., Ash, P. A., Healy, A. J., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy During Electrocatalytic Turnover Reveals the Ni-L Active Site State During H2 Oxidation by a NiFe Hydrogenase. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (24), 7110-7113 (2015).
  37. Grabarczyk, D. B., Ash, P. A., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Role of Dioxygen in the Nitrosylation Pathway of a [2Fe2S] Cluster Iron-Sulfur Protein. J. Am. Chem. Soc. 136 (32), 11236-11239 (2014).
  38. Kriegel, S., Uchida, T., Osawa, M., Friedrich, T., Hellwig, P. Biomimetic Environment to Study E. coli Complex I through Surface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy. Biochemistry. 53 (40), 6340-6347 (2014).
  39. El Khoury, Y., Van Wilderen, L. J. G. W., Bredenbeck, J. Ultrafast 2D-IR spectroelectrochemistry of flavin mononucleotide. J. Chem. Phys. 142 (21), 212416 (2015).
  40. Ash, P. A., et al. Synchrotron-Based Infrared Microanalysis of Biological Redox Processes under Electrochemical Control. Anal. Chem. 88 (13), 6666-6671 (2016).
  41. Nakamoto, K. . Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. Part B. , (2009).
  42. Bard, A., Faulkner, L. R. . Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. , (2001).
  43. Murphy, B. J., et al. Discovery of Dark pH-Dependent H+ Migration in a [NiFe]-Hydrogenase and Its Mechanistic Relevance: Mobilizing the Hydrido Ligand of the Ni-C Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 137 (26), 8484-8489 (2015).
  44. Ash, P. A., et al. Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O2 and CO. J. Phys. Chem. B. 119 (43), 13807-13815 (2015).
  45. Lee, C. -. Y., et al. Theoretical and experimental investigation of surface-confined two-center metalloproteins by large-amplitude Fourier transformed ac voltammetry. J. Electroanal. Chem. 656 (1-2), 293-303 (2011).
  46. Adamson, H., et al. Electrochemical evidence that pyranopterin redox chemistry controls the catalysis of YedY, a mononuclear Mo enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (47), 14506-14511 (2015).
  47. De Lacey, A. L., Fernández, V. M., Rousset, M., Cammack, R. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev. 107 (10), 4304-4330 (2007).
  48. Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., Reijerse, E. Hydrogenases. Chem Rev. 114 (8), 4081-4148 (2014).
  49. Greene, B. L., Wu, C. -. H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton-Coupled Electron Transfer Dynamics in the Catalytic Mechanism of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 137 (13), 4558-4566 (2015).
  50. Greene, B. L., Wu, C. -. H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton Inventory and Dynamics in the Nia-S to Nia-C Transition of a [NiFe] Hydrogenase. Biochemistry. 55 (12), 1813-1825 (2016).
  51. Greene, B. L., Vansuch, G. E., Wu, C. -. H., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Glutamate Gated Proton-Coupled Electron Transfer Activity of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 138 (39), 13013-13021 (2016).
  52. Sezer, M., et al. Role of the HoxZ Subunit in the Electron Transfer Pathway of the Membrane-Bound [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha Immobilized on Electrodes. J. Phys. Chem. B. 115 (34), 10368-10374 (2011).
  53. Heering, H. A., Wiertz, F. G. M., Dekker, C., de Vries, S. Direct Immobilization of Native Yeast Iso-1 Cytochrome c on Bare Gold: Fast Electron Relay to Redox Enzymes and Zeptomole Protein-Film Voltammetry. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 11103-11112 (2004).
  54. dos Santos, L., Climent, V., Blanford, C. F., Armstrong, F. A. Mechanistic studies of the “blue” Cu enzyme, bilirubin oxidase, as a highly efficient electrocatalyst for the oxygen reduction reaction. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (42), 13962-13974 (2010).
  55. Lukey, M. J., et al. How Escherichia coli Is Equipped to Oxidize Hydrogen under Different Redox Conditions. J. Biol. Chem. 285 (6), 3928-3938 (2010).
  56. Jones, A. K., et al. Enzyme Electrokinetics: Electrochemical Studies of the Anaerobic Interconversions between Active and Inactive States of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 125 (28), 8505-8514 (2003).
  57. Quinson, J., et al. Comparison of carbon materials as electrodes for enzyme electrocatalysis: hydrogenase as a case study. Faraday Trans. 172, 473-496 (2014).
  58. Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., Lubitz, W. [NiFe] hydrogenases: A common active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1827 (8-9), 986-1002 (2013).
  59. Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Proton transfer in the catalytic cycle of NiFe hydrogenases: insight from vibrational spectroscopy. ACS Catalysis. , (2017).
  60. Krishnan, S., Armstrong, F. A. Order-of-magnitude enhancement of an enzymatic hydrogen-air fuel cell based on pyrenyl carbon nanostructures. Chem. Sci. 3 (4), 1015-1023 (2012).
  61. Baffert, C., et al. Covalent Attachment of FeFe Hydrogenases to Carbon Electrodes for Direct Electron Transfer. Anal. Chem. 84 (18), 7999-8005 (2012).
  62. Rüdiger, O., et al. Enzymatic Anodes for Hydrogen Fuel Cells based on Covalent Attachment of Ni-Fe Hydrogenases and Direct Electron Transfer to SAM-Modified Gold Electrodes. Electroanal. 22 (7-8), 776-783 (2010).
  63. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell about proteins. Q. Rev. Biophys. 35 (4), 369-430 (2002).
  64. Jiang, X., et al. Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor by surface-enhanced IR difference spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (34), 12113-12117 (2008).
  65. Kottke, T., Lòrenz-Fonfrìa, V. A., Heberle, J. The Grateful Infrared: Sequential Protein Structural Changes Resolved by Infrared Difference Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 121 (2), 335-350 (2017).
  66. Callender, R., Dyer, R. B. The Dynamical Nature of Enzymatic Catalysis. Acc. Chem. Res. 48 (2), 407-413 (2015).
  67. Ciaccafava, A., et al. When the inhibitor tells more than the substrate: the cyanide-bound state of a carbon monoxide dehydrogenase. Chem. Sci. 7 (5), 3162-3171 (2016).
  68. George, S. J., Ashby, G. A., Wharton, C. W., Thorneley, R. N. F. Time-Resolved Binding of Carbon Monoxide to Nitrogenase Monitored by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 119 (27), 6450-6451 (1997).
  69. McPherson, I. J., Ash, P. A., Jacobs, R. M. J., Vincent, K. A. Formate adsorption on Pt nanoparticles during formic acid electro-oxidation: insights from in situ infrared spectroscopy. Chem Commun. 52 (85), 12665-12668 (2016).

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Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).
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