Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme
Summary
Vasküler endotel sıkıca lökosit işe alım denetler. Yetersiz lökosit ekstravazasyonu insan inflamatuar hastalıklar için katkıda bulunur. Bu nedenle, roman yasal unsurları endotel harekete geçirmek için arama enflamatuar bozuklukları için geliştirilmiş terapiler tasarlamak gereklidir. Burada, lökosit enflamasyon sırasında kaçakçılığı değiştirebilirsiniz roman endotel düzenleyiciler ayırdetmek için kapsamlı bir metodoloji açıklayın.
Abstract
Endotel tabakası, birçok farklı fonksiyonları kontrol ederek vücuttaki homeostazı korumak için önemlidir. İnflamatuvar yanıtta endotel tabakası tarafından düzenlenmesi verimli bir şekilde zararlı girişleri karşı mücadele ve hasarlı bölgeleri kurtarma yardım çok önemlidir. Endotel hücreleri gibi gram-negatif bakteri membran, lipopolysaccharide (LPS), dış bileşen inflamatuar bir ortam maruz kaldığı zaman hızlı Ccl5, Cxcl1 ve Cxcl10, gibi çözünebilir pro-inflamatuar sitokinlerin ve tetik lökosit dolaşan harekete geçirmek. Buna ek olarak, ifade adezyon moleküllerinin E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1 endotel yüzeyindeki etkileşim ve endotel tabakası ve sonunda ekstravazasyonu iltihaplı doku doğru harekete geçirmek lökosit yapışma sağlar. Lökosit işe aşırı veya kusurlu harekete geçirmek ilgili enflamatuar bozuklukları için açabilir, çünkü bu senaryoya göre endotel fonksiyonları sıkı bir şekilde düzenlenmiş olması gerekir. Bu yana birçok Bu bozuklukların etkili bir tedavi yok, vasküler katman odaklı bir roman stratejileri araştırılmalı. Lökosit işlevini değiştirin roman endotel düzenleyiciler arama için yararlı olan kapsamlı deneyleri öneriyorum. Biz de dahil olmak üzere çeşitli teknikler ile belirli ifade düşman hedefi lökosit işe alım (örneğin, sitokinler, kemokinler ve adezyon molekülleri) kullanarak endotel aktivasyon analiz: gerçek zamanlı nicel Polimeraz zincir reaksiyonu () RT-qPCR), western-blot, Akış Sitometresi ve yapışma deneyleri. Bu yaklaşımlar endotel fonksiyonları inflamatuar bağlamında belirlemek ve yeni tedavi edici stratejiler tasarlamak için potansiyel olarak değerli roman endotel inflamatuar düzenleyiciler karakterize etmek için tarama testleri gerçekleştirmek çok yararlıdır.
Introduction
İltihabı bulaşıcı ajanlarla patojen ortadan kaldırmak ve hasarlı doku onarımı için büyük amacı karşı faydalı bir biyolojik yanıttır. Kronik enfeksiyonlar veya otoimmün hastalıklar, gibi belirli koşullar altında iltihap gidermez. Bunun yerine, sürekli bir uzun süreli bağışıklık giden doku hasarı, fibrozis, işlev ve genel kayıp, Engellilik ve bazı durumlarda ölüm hastanın tepkisine yol lökosit infiltrasyonu ile anormal bir reaksiyonu vardır. İnflamatuar hastalıklar olarak kataloğa insan bu bozuklukların tümü lökosit ekstravazasyonu1,2kontrolü için kan damarlarının ilgilidir.
Endotel hücreleri lökosit kaçakçılığı kontrol ederek inflamatuar yanıt yönetmelikte temel bir rol oynar. Endotel tabakası LPS gibi inflamatuar aracılar için maruz kaldığında, istirahat endotel etkinleştirir ve pro-inflamatuar sitokinlerin (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, vb) ve adezyon molekülleri (E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1) ifade bu iyilik lökosit enfeksiyon sitesine dolaşan işe alım. Tarafından yayımlanan sitokinler sonra astarlanmalıdır lökosit haddeleme ve muhabir yapışkanlı meslektaşları ile endotel tabakası ile etkileşimi aracılık: PSGL-1 selektin, α4β1 integrin VCAM-1 ve αLβ2 integrin ICAM-1. Son olarak, lökosit damarlara doğru odağı iltihap3arasında göç eder.
Endotel inflamatuar yanıt düzenlenmesinde önemli rol LPS reseptör, toll benzeri reseptör 4 (TLR4), endotel hücreleri üzerinde sadece hızlı için genetik olarak değiştirilmiş fareler üzerinde gösterilmiştir. Bu TLR4 endotel hayvanlar yanıt vermek bir LPS-aracılı inflamasyon ve enfeksiyon bakteri aşılama sonra oluşturulan tespit ve sonuç olarak enfeksiyon çözünürlük ve vahşi tip fareler4 olarak benzer düzeyde hayatta elde başardık , 5.
İnflamatuar yanıt endotel düzenlenmiştir pathway için lökosit-endotel etkileşim bazı aşamalarında inhibisyonu trans-endotel geçiş ve için daha iyi bir prognoz azaltılması neden olacağından bu öne inflamatuar bağlı hastalıklar. Aslında, çeşitli stratejiler endotel harekete geçirmek ve lökosit-endotel etkileşim hedefleme enflamatuar bozuklukları6,7için bir tedavi olarak bağışıklık hücre ekstravazasyonu engellemek için tasarlanmıştır.
Bu raporu, vitro teknikleri tam olarak karakterize enflamatuar uyarıcı LPS karşılık olarak endotel aktivite ve lökosit harekete geçirmek ve yapışma vasküler katmana rolü için kapsamlı bir grup açıklamak. Bu el yazması kullanılan endotel hücre model fare akciğer endotel hücre satırı (MLEC-04), Hortelano ve ark. tarafından açıklandığı gibi oldu 8. MLEC-04 hücre kültürünü endotel harekete geçirmek9,10çalışmaya uygun bir sistem olarak literatürde doğrulanmış. Araştırma çıkarlara dayanan, bu yaklaşımların kolayca herhangi bir endotel yaygınlaştırılması veya lökosit sistemleri ve inflamatuar profil. Seçilen koşullar endotel parametrelerinde tanımladıktan sonra sistem vasküler harekete geçirmek değerlendirmek için önerilen deneme roman uyuşturucu test edebilirsiniz. İnflamatuar bu bağlamda faiz bileşik ile test endotel hücre hücreleri kontrol şartları karşılaştırılabilir ve ortaya çıkan farklılık gelişme ve ilerleme inflamasyon ilacın prognostik sonuç bilgilendirebilir. Sonuç olarak, yeni uyuşturucu hedefler roman vasküler özgü terapiler inflamatuar ilgili hastalıklara karşı tasarımını etkileyebilecek endotel hücreleri, karakterize etmek için bir sistem teklif ediyorum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Roman mekanizmaları inflamatuar yanıt yönetmelikte yer keşfetmek için zemin oluşturur kademeli bir teknoloji bu endotel protokolünü açıklar. Bu yaklaşımlar endotel faaliyetinin LPS tarafından uyarılan çalışmaya dayanarak ve lökosit işe inflamatuar yanıt sırasında özellikle dahil kritik adımları değerlendirmek: endotel sitokinler açıklaması, endotel yapışma Vasküler katmana molekülleri ifade ve lökosit yapışma. Endotel parametreleri oluşturulduktan sonra sistem yeni bileşikler endotel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser “gayri resmi” de Economía y Competitividad (MINECO) ve Instituto de tarafından desteklenmiştir Salud Carlos III (ISCIII) (grant sayıya IERPY 1149/16 al; MPY 1410/09 için S. Hortelano); tarafından MINECO Fondo de Investigación tr Salud (FIS) (verir numaraları PI11.0036 ve PI14.0055, S. Hortelano) aracılığıyla. S. Herranz tarafından IERPY 1149/16’dan ISCIII destek verdi.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
