הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית
Summary
אנדותל כלי הדם שולט בחוזקה ליקוציט גיוס. ליקוציט לקוי extravasation תורם למחלות דלקתיות. לכן, בחיפוש אחר הרומן יסודות ההפעלה אנדותל תקינה יש צורך לעצב משופרת טיפולים עבור הפרעות דלקתיות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה לאפיון הרומן הרגולטורים אנדותל היכולות לשנות ליקוציט סחר בעת דלקת.
Abstract
שכבת אנדותל חיוני לשמירה על הומאוסטזיס בגוף על ידי שליטה פונקציות שונות. ויסות התגובה דלקתיות על ידי השכבה אנדותל חיוני להילחם ביעילות נגד מזיקים תשומות וסיוע בשחזור של אזורים פגועים. כאשר תאי אנדותל נחשפים סביבה דלקתית, כגון הרכיב החיצוני של הממברנה חיידקים גראם שליליים, ליפופוליסכריד (LPS), הם אקספרס ציטוקינים פרו-דלקתיים מסיסים, כמו Ccl5, Cxcl1 ו- Cxcl10, ויפעיל הפעלה של מחזורי לויקוציטים. בנוסף, הביטוי של מולקולות אדהזיה E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1 על פני אנדותל מאפשר את האינטראקציה והצמדות לויקוציטים מופעל את שכבת אנדותל, בסופו של דבר את extravasation לעבר הרקמה מודלק. בתרחיש זה, הפונקציה אנדותל חייב להיות בחוזקה מוסדר כי הפעלה מוגזמת או פגומה בלשכת הגיוס ליקוציט עלול לגרום הפרעות הקשורות דלקתיות. מאז רבים של הפרעות אלה אין טיפול יעיל, חובה לחקור אסטרטגיות מקוריות עם דגש על שכבת כלי הדם. אנו מציעים מקיף מבחני שימושיות החיפוש של הרומן הרגולטורים אנדותל המשנים ליקוציט פונקציה. אנחנו מנתחים את הפעלת אנדותל באמצעות ביטוי ספציפי מטרות מעורב בגיוס ליקוציט (כגון, ציטוקינים, נוגדנים, מולקולות אדהזיה) עם מספר טכניקות, לרבות: (תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת RT-qPCR), במערב-כתם, flow cytometry והצמדות מבחני. גישות אלה לקבוע פונקציה אנדותל בהקשר דלקתיות, שימושי מאוד לביצוע מבחני המיון כדי לאפיין את הרומן הרגולטורים דלקתיות אנדותל שנמצאים ערך פוטנציאלי עבור תכנון אסטרטגיות טיפוליות חדשות.
Introduction
דלקת היא תגובת ביולוגי מועיל נגד מדבקים, עם המטרה הגדולות כדי לחסל את המחלה ותיקון רקמות שנפגעו. בתנאים מסוימים, כגון דלקות כרוניות או מחלות אוטואימוניות, דלקת לא נפתרת. במקום זאת, יש לתגובה חריגה עם חדירה מתמשכת של לויקוציטים, וכתוצאה מכך לתגובה החיסונית ממושך שמובילה נזק לרקמות, פיברוזיס, אובדן של הפונקציה, כללי, נכות, במוות כמה מקרים של המטופל. הפרעות אלה אנושי, ממוין כמו מחלות דלקתיות, כל לערב את כלי הדם עבור הפקד ליקוציט extravasation1,2.
תאי אנדותל לשחק תפקיד מהותי בוויסות התגובה דלקתיות על ידי שליטה ליקוציט סחר. כאשר שכבת אנדותל חשוף מתווכים דלקתיים כגון LPS, אנדותל מנוחתו מפעיל, מבטא ציטוקינים פרו-דלקתיים (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, וכו ‘), מולקולות אדהזיה (E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1) הטובה. גיוס של מחזורי לויקוציטים לאתר זיהום. לויקוציטים טענתי על ידי ציטוקינים שפורסמו אז לתווך מתגלגל ואינטראקציה עם השכבה אנדותל באמצעות עמיתיהם דבק כתב: PSGL-1 בחירת שמלות, α4β1 אינטגרין VCAM-1 של אינטגרין αLβ2 ICAM-1. לבסוף, לויקוציטים נודדים על פני להערכת לכיוון המוקד של דלקת3.
התפקיד החיוני של אנדותל בוויסות התגובה דלקתיות הוכח על עכברים ששונו גנטית כדי לבטא את קולטן LPS, קולטן דמוי אגרה 4 (TLR4), רק על תאי אנדותל. בעלי חיים אלה אנדותל-TLR4 הצליחו להגיב כדי דלקת בתיווך LPS וכדי לזהות את הזיהום שנוצר לאחר חיסון חיידקים, וכתוצאה מכך להשיג רזולוציה זיהום והישרדות ברמות דומות כמו עכברים פראי סוג4 , 5.
עבור מסלול מוסדר אנדותל תגובה דלקתית, אותו יש כבר הניחו כי עיכוב בשלבים מסוימים של האינטראקציה ליקוציט-אנדותל כתוצאה צמצום הגירה טראנס-אנדותל, פרוגנוזה טובה יותר עבור מחלות דלקתיות הקשורות. למעשה, מספר אסטרטגיות מיקוד האינטראקציה הפעלה, ליקוציט-אנדותל אנדותל עוצבו כדי לעכב את extravasation של תאים חיסוניים לטיפול הפרעות דלקתיות6,7.
בדו ח זה, אנו מתארים קבוצה יסודית של שיטות in vitro לקשרי לאפיין באופן מלא את הפעילות אנדותל בתגובה התקליטים גירוי דלקתי ותפקידו ליקוציט הפעלה והצמדות על שכבת כלי הדם. המודל תא אנדותל בשימוש כתב יד זה היה הקו תא אנדותל הריאות העכבר (MLEC-04), כפי שתואר על ידי. Hortelano et al. 8. שורת התאים MLEC ה-04 אומתה בספרות להיות מערכת המתאים ללמוד הפעלה אנדותל9,10. בהתבסס על תחומי המחקר, גישות אלה יכול להיות בקלות אקסטרפולציה בכל אנדותל או מערכות ליקוציט ופרופיל דלקתיות. לאחר הגדרת הפרמטרים אנדותל בתנאים שנבחר, המערכת באפשרותך לבדוק תרופות חדישות על הניסויים המוצע כדי להעריך את הפעלת כלי הדם. בהקשר זה דלקתיות, תאי אנדותל נבדק עם המתחם עניין ניתן להשוות את תנאי הבקרה של התאים, כל ההבדלים וכתוצאה מכך יכול לעדכן את התוצאה prognostic של התרופה על התפתחות והתקדמות של דלקת. לסיכום, אנו מציעים מערכת הרלוונטיים לאפיון מטרות חדשות סמים לתאי אנדותל, אשר יכולים להשפיע על העיצוב של טיפולים ספציפיים וסקולרית נגד מחלות דלקתיות הקשורות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול אנדותל זה מתאר טכנולוגיה stepwise היוצרת את היסודות לחקר מנגנוני הרומן מעורב בוויסות התגובה דלקתיות. גישות אלה מבוססים על המחקר של הפעילות אנדותל מגורה על ידי LPS ולהעריך את השלבים הקריטיים מעורב ליקוציט הגיוס במהלך לתגובה דלקתית, במיוחד: שחרור ציטוקינים אנדותל, אדהזיה אנדותל מולקול?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי y Ministerio דה Economía Competitividad (MINECO) ודה אינסטיטוטו סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (מענק מספר IERPY 1149/16 א. ל; MPY 1410/09 ל S. Hortelano); על ידי MINECO דרך en Fondo Investigación דה סאלוד (FIS) (מעניקה מספרים PI11.0036 ו- PI14.0055 S. Hortelano). ס Herranz נתמכה על-ידי IERPY 1149/16 מ ISCIII.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
