Selección de ensayos para caracterizar nuevos reguladores endoteliales implicados en la respuesta inflamatoria
Summary
Endotelio vascular controla firmemente el reclutamiento leucocitario. Extravasación leucocitaria inadecuada contribuye a enfermedades inflamatorias humanas. Por lo tanto, es necesario diseñar mejores terapias para trastornos inflamatorios buscando nuevos elementos reguladores de la activación endotelial. Aquí, describimos una completa metodología para caracterizar nuevos reguladores endoteliales que pueden modificar el tráfico de leucocitos durante la inflamación.
Abstract
La capa endotelial es esencial para mantener la homeostasis en el cuerpo mediante el control de muchas funciones diferentes. Regulación de la respuesta inflamatoria por la capa endotelial es crucial para combatir eficientemente insumos perjudiciales y ayuda en la recuperación de áreas dañadas. Cuando las células endoteliales están expuestas a un ambiente inflamatorio, como el componente externo de la membrana de bacterias Gram-negativas, lipopolisacárido (LPS), express soluble citoquinas proinflamatorias, tales como Ccl5, Cxcl1 y Cxcl10 y desencadenar la activación de leucocitos en circulación. Además, la expresión de moléculas de adhesión E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1 en la superficie endotelial permite la interacción y adhesión de los leucocitos activados a la capa endotelial y finalmente la extravasación hacia los tejidos inflamados. En este escenario, la función endotelial debe ser estrictamente regulada debido a una activación excesiva o defectuosa en el reclutamiento de leucocitos podría conducir a trastornos inflamatorios. Puesto que muchos de estos trastornos no tienen un tratamiento eficaz, deben investigarse nuevas estrategias con un enfoque en la capa vascular. Proponemos el análisis integrales que son útiles para la búsqueda de nuevos reguladores endoteliales que modifican la función leucocitaria. Analizamos activación endotelial utilizando objetivos de expresión específicos involucrados en el reclutamiento de leucocitos (por ejemplo, citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión) con varias técnicas, incluyendo: (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real RT-qPCR), western-blot, ensayos de citometría y adhesión de flujo. Estos enfoques determinan la función endotelial en el contexto inflamatorio y son muy útiles para llevar a cabo ensayos de investigación para caracterizar nuevos reguladores inflamatorios endoteliales que son potencialmente valiosos para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.
Introduction
La inflamación es una respuesta biológica beneficiosa frente a agentes infecciosos, con el objetivo principal para eliminar el patógeno y reparar el tejido dañado. Bajo ciertas condiciones, como infecciones crónicas o enfermedades autoinmunes, la inflamación no se resuelve. En cambio, es una reacción aberrante con la continua infiltración de leucocitos, dando por resultado una respuesta inmune prolongada que conduce a daño de tejido, fibrosis, pérdida de función y en general, discapacidad y en algunos casos la muerte del paciente. Estos trastornos humanos, catalogados como enfermedades inflamatorias, todas involucran los vasos sanguíneos para el control de leucocitos extravasación1,2.
Las células endoteliales juegan un papel fundamental en la regulación de la respuesta inflamatoria al controlar el tráfico de leucocitos. Cuando la capa endotelial está expuesta a mediadores inflamatorios tales como el LPS, el endotelio reposo activa y expresa las citoquinas pro inflamatorias (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) y moléculas de adhesión (E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1) que favorecen reclutamiento de leucocitos al sitio de infección de la circulación. Los leucocitos preparados por las citoquinas liberadas entonces median del balanceo y la interacción con la capa endotelial a través de las correspondientes contrapartes adhesivo: PSGL-1 y selectina, la integrina α4β1 VCAM-1, αLβ2 integrina ICAM-1. Finalmente, los leucocitos migran a través de la vasculatura hacia el foco de inflamación3.
El papel esencial del endotelio en la regulación de la respuesta inflamatoria se ha demostrado en ratones que fueron genéticamente modificados para expresar el receptor de LPS, el receptor de tipo toll 4 (TLR4), sólo en las células endoteliales. Estos animales endotelial TLR4 eran capaces de responder a una inflamación mediada por el LPS y para detectar la infección generada después de la inoculación de bacterias y en consecuencia lograr la resolución de la infección y supervivencia en niveles similares como los ratones de tipo salvaje4 , 5.
Por la vía de la respuesta inflamatoria regulada por el endotelio, se ha postulado que la inhibición en algunas etapas de la interacción leucocito endotelio daría lugar a la reducción de la migración trans-endotelial y un mejor pronóstico para enfermedades inflamatorias. De hecho, diversas estrategias dirigidas a la interacción endotelial activación y leucocito endotelio han sido diseñados para impedir la extravasación de células inmunitarias como tratamiento para trastornos inflamatorios6,7.
En este informe, describimos un grupo completo de en vitro técnicas para caracterizar completamente la actividad endotelial en respuesta a los LPS de estímulo inflamatorio y su papel en la activación del leucocito y adherencia a la capa vascular. El modelo de célula endotelial utilizado en este manuscrito fue la línea de células endoteliales de pulmón de ratón (LMCE-04), según lo descrito por Hortelano et al. 8. línea de celular de la LMCE-04 ha sido validado en la literatura un sistema apropiado para el estudio de activación endotelial9,10. Basado en sus intereses de investigación, estos enfoques se pueden extrapolar fácilmente a cualquier endotelial o sistemas del leucocito y el perfil inflamatorio. Una vez definidos los parámetros endoteliales en las condiciones seleccionadas, el sistema puede probar nuevos fármacos en la experimentación propuesta para evaluar la activación vascular. En este contexto inflamatorio, las células del endotelio con el compuesto de interés pueden ser comparadas con las condiciones de control de las células, y las diferencias resultantes pueden informar resultado pronóstico del fármaco sobre el desarrollo y progresión de la inflamación. Para concluir, proponemos un sistema relevante para caracterizar nuevos objetivos de medicamentos a las células endoteliales, que pueden influir en el diseño de nuevas terapias vasculares específicos contra enfermedades inflamatorias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo endotelial describe una tecnología paso a paso que establece las bases para explorar nuevos mecanismos implicados en la regulación de la respuesta inflamatoria. Estos enfoques se basan en el estudio de la actividad endotelial estimulado por LPS y evaluar los pasos críticos involucrados en el reclutamiento de leucocitos durante la respuesta inflamatoria, específicamente: liberación de citoquinas endotelial, adhesión endotelial las moléculas expresión y leucocito adherencia a la capa vascular. Una ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) y el Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (número de licencia IERPY 1149/16 para A.L.; MPY 1410/09 para S. Hortelano); por el MINECO a través del Fondo de Investigación en Salud (FIS) (otorga números PI11.0036 y PI14.0055 a S. Hortelano). S. Herranz fue apoyada por IERPY 1149/16 del ISCIII.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
References
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