JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em> קסנופוס</em> התפתחות עובריים

Published: June 15, 2017
doi:
10.3791/55823
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program,University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

Abstract

פעילות קינאז היא קריטית עבור שפע של פונקציות הסלולר, כולל התפשטות תאים, בידול, הגירה, אפופטוזיס. במהלך התפתחות עובריים מוקדם, פעילות קינאז הוא דינמי מאוד נפוץ על פני העובר. גישות פרמקולוגיות וגנטיות משמשים בדרך כלל לחקר פעילות קינאז. למרבה הצער, זה מאתגר להשיג רזולוציה מרחבית וטמפורלית מעולה באמצעות אסטרטגיות אלה. יתר על כן, אין זה אפשרי לשלוט בפעילות קינאז באופן הפיך בתאים חיים ואורגניזמים רב תאיים. מגבלה כזו נותרה צוואר בקבוק להשגת הבנה כמותית של פעילות קינאז במהלך הפיתוח וההבחנה. עבודה זו מציגה אסטרטגיה optogenetic כי מנצל מערכת bicistronic המכיל חלבונים photoactivatable ארבידופסיס thaliana cryptochrome 2 (CRY2) ו N- מסוף מושלם של cryptochrome אינטראקציה סליל בסיסי לולאה סליל (CIBN). רברסיהפעלת BL של מיגוגן המופעל קינאז חלבון (MAPK) נתיב איתות מושגת באמצעות טרנספורמציה חלבון אור בתיווך תאים חיים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על תרבויות תאים יונקים ועוברי חוליות לחיות. מערכת bicistronic זו יכולה להיות כללית כדי לשלוט בפעילות של קינאזות אחרות עם מנגנוני הפעלה דומים ניתן להחיל על מערכות מודל אחרים.

Introduction

גורמי גדילה מעורבים במגוון רחב של תפקודי תאים, כולל התפשטות, הבחנה, הגירה ואפופטוזיס, וכן תפקידים מרכזיים באירועים ביולוגיים רבים, כולל התפתחות עובריים, הזדקנות, והסדרת המעמד הנפשי 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . גורמי גדילה רבים אותות דרך מפלי איתות תאיים מורכבים. אירועים אלה איתות מופעלים לעתים קרובות על ידי זירזון הפיך החלבון בצורה מסודרת במדויק 6 , 7 . לכן, הבנה של תוצאות איתות של קינאזות חלבון, אשר אחראים על זרחון חלבון, הוא חשוב ביסודו.

גורמי גדילה שונים פועלים באמצעות רשת איתות תאית שכיחה למדי, למרות שהם מעוררים את הדיסטתגובות סלולר Inct 8 , 9 . מתווכים תאיים נפוצים של קינאזות קולטן טירוזין כוללים ראס, רף, קינאז של תאית (ERK), מינוגנים המופעלים על ידי מיטרוגן (MAPK) / ERK Kinase (MEK), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Akt ו- phospholipase C (PLCγ) 10 , 11 . צבירת עדויות מצביעה על כך שהסימן לגיוון ולספציפיות תלוי בהסדרה המרחבית והזמנית של פעילות איתות. לדוגמה, בתאי pheochromocytoma חולדה (PC12), גורם לגדילה של גורם האפידרמיס (EGF), אשר גורם להתפשטות תאים, מפעיל באופן זמני את מסלול ERK 9 . מצד שני, גירוי עם גורם הגדילה העצבי (NGF), אשר מוביל התמיינות תאים, מפעיל את מסלול ERK באופן מתמשך 9 , 13 . ב תרבותי rעל נוירונים בהיפוקמפוס, איתות חולף על ידי גורם נוירוטרופי המופק מהמוח (BDNF) מקדם תולדה נייוריטית ראשונית, בעוד סיגנלי מתמשכת מוביל לעלייה ניורית הסתעפות 14 . במהלך התפתחות עובריים מוקדם, פעילות ERK phosphorylated הוא דינמי זמנית הוא נפוץ על פני העובר 6 . מסך גנטי עדכני במהלך אמבריוגנזה מוקדמת של Xenopus הראה ש- ERK ו- Akt cascades איתותים, שני מסלולי גורם עיקרי לצמיחה במורד הזרם, הצגת פרופילי הפעלה ספציפיים לשלב. לכן, הבנה של תוצאות איתות kinase קורא כלים שיכולים לחקור את המאפיינים המרחביים והזמן של פעילות קינאז עם רזולוציה מספקת.

גישות ניסיוניות קונבנציונאלי לחקור את הטבע הדינמי של התמרה האות במהלך הפיתוח חוסר ברזולוציה מרחבית וזמני רצוי. לדוגמה, גישות תרופתי לנצל כימית קטנהאו מולקולות ביולוגיות כדי לעורר או לדכא את התמרת האותות בתאים וברקמות. האופי המפוזר של מולקולות קטנות אלה מקשה על הגבלת פעולתן לאזור מסוים של עניין. גישות גנטיות ( למשל, transgenesis, מערכת Cre-Lox, או mutagenesis) לעתים קרובות להוביל הפעלה בלתי הפיכה או הדחקה של ביטוי הגן היעד או פעילות חלבון 16 , 17 , 18 . מערכת Tet-On / Tet-Off 19 מציעה בקרה משופרת בזמן של תעתיק גנים, אך חסרת שליטה מרחבית קפדנית משום שהיא מסתמכת על דיפוזיה של טטרציקלין. ההתפתחויות האחרונות ב dimerization חלבון המושרה כימית 20 או תמונה-unaging 21 , 22 , 23 , 24 יש לשפר מאודאד שליטה זמנית של רשתות איתות. השליטה המרחבית, לעומת זאת, נותרה מאתגרת בשל אופים המפוזר של הכימיקלים הכלובים.

גישות optogenetic המתעוררים לאחרונה, אשר לרתום את כוחו של האור כדי לשלוט אינטראקציות חלבון חלבונים, לאפשר אפנון של מסלולי איתות עם דיוק גבוהה spatiotemporal וכן הפיכות. זמן קצר לאחר הצלחתו הראשונית בשליטה על הירי העצבני 25 , 26 , 27 , אופטוגנטיקה הורחבה כדי לשלוט בתהליכים תאיים אחרים, כגון תעתיק גנים, תרגום, נדידת תאים, הבחנה ואפופטוזיס 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . אסטרטגיה באמצעות pצמד חלבון של חלבון חלבון (CIBN), שפותח לאחרונה על מנת לשלוט בפעילות רפא 1 קינאז בתאי יונקים ועוברים של קסנופוס 35 . CRY2 נקשר ל- CIBN עם גירוי כחול-בהיר, ומרכיב החלבון CRY2 / CIBN מתנתק באופן ספונטני בחשיכה. אור כחול מרגש את cofactor CRY2, flavin adenine dinucleotide (FAD), אשר מוביל לשינוי קונפורמיטיבי CRY2 ואת מחייב לאחר מכן CIBN. מוטציות אקטיביות (W374A) ו flavin לקוי (D387A) מוטציות CRY2 ניתן לייצר באמצעות מוטציות בכיס FAD מחייב: מוטציה CRY2 W374A נקשר CIBN עצמאית של אור, ואילו מוטציה CRY2 D387A לא להיקשר CIBN תחת כחול גירוי אור 36 , 37 . המערכת האופטו-גנטית המתוארת iN זה פרוטוקול משתמש wild-type CRY2 ו CIBN כדי לגרום להפעלת טרשת נפוצה transocal בתיווך פעולה RF1 בתאים חיים. זה ידוע כי גיוס הממברנה של Raf1 משפר את פעילותה 38 . במערכת זו, מודול CIBN טנדם מעוגן לקרום הפלזמה ו- CRY2-mCherry מתמזג למסוף N של רף 35 . בהיעדר אור כחול, CRY2-mCherry-Raf1 נשאר בציטופלזמה, ו- Raf1 אינו פעיל. גירוי כחול-אור גורם לכריכה של CRY2-CIBN ומגייס את ה- RF1 לממברנת הפלזמה, שם מופעל RF1. הפעלת רף מגרה מפל איתות של RF / MEK / ERK. שני חלבונים CRY2- ו CIBN- היתוך מקודדים במערכת גנטית bicistronic. אסטרטגיה זו יכולה להיות generalized לשלוט קינאזות אחרות, כגון Akt, אשר מצב ההפעלה יכול גם להיות מופעל על ידי טרנסלוקציה חלבון בתאים 39 . עבודה זו מציגה פרוטוקולים מפורטים ליישום אסטרטגיה זו optogenetic ב cultu תא יונקיםרס ואורגניזמים תאיים.

Protocol

מחקר בבעלי חיים נערך על פי הנחיות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של אילינוי ושימוש ועדת (IACUC) ואת אוניברסיטת אילינוי המחלקה של בעלי חיים משאבים (DAR). 1. אינדוקציה Optogenetic של לוקליזציה חלבון ב BHK21 תרבית תאים יונקים <p class="jove_content…

Representative Results

ביטוי Ratiometric של זוגות חלבון Photoactivatable: איור 1A מראה את העיצוב של מבנה optogenetic bicistronic, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (המכונה CRY2-2A-2CIBN), המבוססת על teschovirum חזירי- 1 2A (P2A) פפטיד, אשר מראה את היעילות הגבוהה ביותר ריבוזום-דילוג בין שורות תאים יונקים <sup class="…

Discussion

בעת בניית תיבת האור, את הכוח של נוריות LED בודדות יש למדוד. בהתבסס על ניסיון קודם, תפוקת החשמל יכולה להשתנות בין נוריות LED בודדות עקב שונות בייצור. בחר קבוצה של נוריות כי יש פלט כוח בתוך 10% אחד מהשני. מספר נוריות, הנגד המגביל הנוכחי, ואת קלט הכוח יכול להיות שונה עבור סוגים ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אילינוי ב Urbana-Champaign (UIUC) ואת המכונים הלאומיים לבריאות (NIGMS R01GM111816).

Materials

Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling–2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Tags

Light-mediatedReversible ModulationMitogen-activated Protein Kinase PathwayCell DifferentiationXenopus Embryonic DevelopmentOptogenetic InductionCIBN-CRY2 InteractionFluorescence ImagingPHK21 CellsCRY2-mCherry-Raf1 Plasmid

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image