Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em> Xenopus</em> Desarrollo embrionario

Los factores de crecimiento están involucrados en un amplio espectro de funciones celulares, incluyendo proliferación, diferenciación, migración y apoptosis, y juegan papeles cruciales en muchos eventos biológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, el envejecimiento y la regulación del estado mental ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Muchos factores de crecimiento señalan a través de complejas cascadas de señalización intracelular. Estos eventos de señalización son a menudo operados por la fosforilación de proteínas reversible de una manera regulada con precisión ^{6 , 7} . Por lo tanto, una comprensión de los resultados de señalización de las proteínas quinasas, que son responsables de la fosforilación de proteínas, es fundamentalmente importante.

Diferentes factores de crecimiento actúan a través de una red de señalización intracelular bastante común, aunque estimulan distInct respuestas celulares [ ^{8 , 9]} . Los mediadores intracelulares comunes de las tirosina quinasas receptoras incluyen Ras, Raf, quinasa regulada por señal extracelular (ERK), proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) / ERK quinasa (MEK), phosphoinositide 3-quinasa (PI3K), Akt y fosfolipasa C gamma (PLC $ γ $) ^{10 , 11} . La acumulación de pruebas sugiere que la señalización de la diversidad y la especificidad dependen de la regulación espacial y temporal de la actividad de señalización [ ^12] . Por ejemplo, en las células de feocromocitoma de rata (PC12), estimulación del factor de crecimiento epidérmico (EGF), lo que resulta en la proliferación celular, transitoriamente activa la vía ERK [ ^9] . Por otra parte, la estimulación con factor de crecimiento nervioso (NGF), que conduce a la diferenciación celular, activa la vía ERK de una manera sostenida [ ^{9 , 13]} . En cultivo rEn las neuronas del hipocampo, la señalización transitoria por el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) promueve el crecimiento de las neuritas primarias, mientras que la señalización sostenida conduce a una mayor ramificación de neuritas ¹⁴ . Durante el desarrollo embrionario temprano, phosphorylated ERK actividad es temporalmente dinámica y está extendida a través del embrión [ ^6] . Una reciente pantalla genética durante la embriogénesis Xenopus temprana mostró que ERK y Akt cascadas de señalización, dos vías del factor de crecimiento primario aguas abajo, mostrar la etapa específica de activación perfiles [ ^7] . Por lo tanto, la comprensión de los resultados de la señalización quinasa requiere de herramientas que pueden sondear las características espaciales y temporales de la actividad quinasa con suficiente resolución.

Los enfoques experimentales convencionales para investigar la naturaleza dinámica de la transducción de señales durante el desarrollo carecen de la resolución espacial y temporal deseable. Por ejemplo, los enfoques farmacológicos utilizanO biológicas para estimular o suprimir la transducción de señales en células y tejidos. La naturaleza difusiva de estas pequeñas moléculas hace que sea difícil restringir su acción a una región específica de interés [ ^15] . Los enfoques genéticos ( por ejemplo, la transgénesis, el sistema Cre-Lox o mutagénesis) a menudo conducen a la activación o represión irreversible de la expresión del gen diana o la actividad proteica ^{16 , 17 , 18} . El sistema Tet-On / Tet-Off ¹⁹ ofrece un control temporal mejorado de la transcripción de genes, pero carece de un control espacial estricto porque se basa en la difusión de la tetraciclina. Los desarrollos recientes en la dimerización de la proteína inducida químicamente ²⁰ o la foto-descoloración ^{21 , 22 , 23 , 24} han mejorado enormementeControl temporal de las redes de señalización. El control espacial, sin embargo, sigue siendo un desafío debido a la naturaleza difusiva de los productos químicos enjaulados.

Los recientes enfoques optogenéticos emergentes, que aprovechan la potencia de la luz para controlar las interacciones proteína-proteína, permiten la modulación de vías de señalización con una alta precisión espaciotemporal y reversibilidad. Poco después de su éxito inicial en el control de disparo neuronal ^{25 , 26 , 27} , optogenetics se ha extendido para controlar otros procesos celulares, tales como la transcripción de genes, la traducción, la migración celular, la diferenciación y la apoptosis ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34} . Una estrategia con la pHotoactivatable proteína de parche Arabidopsis thaliana criptocromo 2 (CRY2) de proteínas y el dominio N-terminal de criptocromo de interacción de hélice-hélice-hélice (CIBN) se ha desarrollado recientemente para controlar Raf1 kinasa actividad en células de mamíferos y Xenopus embriones [ ^35] . CRY2 se une a CIBN a la luz azul de estimulación, y el complejo de proteínas CRY2 / CIBN se disocia espontáneamente en la oscuridad [ ^34] . La luz azul excita el cofactor CRY2, flavin adenine dinucleotide (FAD), que conduce a un cambio conformacional en CRY2 y su posterior unión a CIBN. Pueden producirse mutantes constitutivamente activos (W374A) y deficientes en flavina (D387A) de CRY2 a través de mutaciones en la bolsa de unión a FAD: el mutante W374A de ^CRY2 se une a CIBN independiente de la luz, mientras que el mutante CRY2 ^D387A no se une a CIBN bajo azul – estimulación de luz ^{36 , 37} . El sistema optogenético descrito iN este protocolo utiliza CRY2 de tipo salvaje y CIBN para inducir la activación de Raf1 mediada por translocación de proteínas en células vivas. Se sabe que el reclutamiento de membrana de Raf1 mejora su actividad ³⁸ . En este sistema, un tándem CIBN módulo está anclado a la membrana plasmática y CRY2-mCherry se fusiona con el N-terminal de Raf1 ³⁵ . En ausencia de luz azul, CRY2-mCherry-Raf1 permanece en el citoplasma, y ​​Raf1 es inactivo. La estimulación con luz azul induce la unión de CRY2-CIBN y recluta Raf1 en la membrana plasmática, donde Raf1 se activa. La activación de Raf estimula una cascada de señalización Raf / MEK / ERK. Las proteínas de fusión CRY2 y CIBN están codificadas en un sistema genético bicistrónico. Esta estrategia puede ser generalizada para controlar otras quinasas, como Akt, cuyo estado de activación también puede ser activado por la translocación de proteínas en las células [ ^39] . Este trabajo presenta protocolos detallados para la implementación de esta estrategia optogenética en cultu de células de mamíferosRes y organismos multicelulares.