細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em>アフリカツメガエル</em>胚発生

増殖因子は、増殖、分化、遊走、およびアポトーシスを含む広範囲の細胞機能に関与し、胚発生、老化および精神状態の調節1,2,3,4,5などの多くの生物学的事象において中心的な役割を果たす。 ⁵ 。多くの増殖因子は、複雑な細胞内シグナル伝達カスケードを介してシグナル伝達する。これらのシグナル伝達事象は、しばしば可逆的なタンパク質リン酸化によって正確に制御された様式で操作される6,7。従って、タンパク質リン酸化を担うプロテインキナーゼのシグナル伝達結果の理解は基本的に重要である。

異なる成長因子は、それらがdistを刺激するにもかかわらず、むしろ一般的な細胞内シグナル伝達ネットワークを介して作用するinct細胞応答^8,9 。レセプターチロシンキナーゼの一般的な細胞内メディエーターには、Ras、Raf、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）/ ERKキナーゼ（MEK）、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）、AktおよびホスホリパーゼCガンマ（PLCγ） ^10,11 。シグナリングの多様性および特異性は、シグナル伝達活性の空間的および時間的調節に依存することが示唆されている¹² 。例えば、ラット褐色細胞腫細胞（PC12）において、細胞増殖をもたらす表皮成長因子（EGF）刺激は、ERK経路を一時的に活性化する⁹ 。一方、細胞分化につながる神経成長因子（NGF）による刺激は、ERK経路を持続的に活性化させる9,13。培養rにおいて海馬ニューロンでは、脳由来神経栄養因子（BDNF）による一過性シグナル伝達が原発性神経突起伸長を促進するが、持続シグナル伝達は神経突起分岐の増加^14につながる。初期胚発生の間、リン酸化されたERK活性は時間的に動的であり、胚⁶に広がっている。初期のアフリカツメガエル胚発生中の最近の遺伝子スクリーニングでは、下流の原発性増殖因子経路の2つのERKおよびAktシグナル伝達カスケードがステージ特異的活性化プロファイルを^{示すことが示された7} 。したがって、キナーゼシグナル伝達結果の理解は、十分な分解能でキナーゼ活性の空間的および時間的特徴を調べることができるツールを必要とする。

開発中のシグナル伝達の動的性質を調べるための従来の実験的アプローチは、望ましい空間的および時間的解像度を欠く。例えば、薬理学的アプローチは、細胞または組織中のシグナル伝達を刺激または抑制するための生体分子または生体分子である。これらの小分子の拡散性は、その作用を特定の関心領域¹⁵に制限することを困難にする。遺伝的アプローチ（ 例えば、遺伝子導入、Cre-Loxシステム、または突然変異誘発）は、しばしば標的遺伝子発現またはタンパク質活性の不可逆的な活性化または抑制を導く16,17,18。 Tet-On / Tet-Offシステム¹⁹は、遺伝子転写の改善された時間的制御を提供するが、テトラサイクリンの拡散に依存するため、厳密な空間制御を欠いている。化学的に誘導されたタンパク質二量体化²⁰または光未結合化21,22,23,24の最近の進展は^、シグナリングネットワークの時間的制御を可能にする。しかしながら、空間制御は、ケージド化学物質の拡散性のために依然として困難である。

タンパク質 – タンパク質相互作用を制御するために光のパワーを利用する最近の出現するオプトジェネティックアプローチは、高い時空間精度および可逆性を有するシグナル伝達経路の調節を可能にする。ニューロンの発火を制御する初期の成功の直後に、遺伝子の転写、翻訳、細胞遊走、分化、およびアポトーシスなどの他の細胞プロセスを制御するためにオプトジェネティクスが拡張されている28,29,30,31,32,33 ^{、 34} 。 pを使った戦略（CRY2）タンパク質とクリプトクローム相互作用塩基性ヘリックスループヘリックス（CIBN）のN末端ドメインは、最近、哺乳動物細胞およびアフリカツメガエル胚のRaf1キナーゼ活性を制御するために開発された³⁵ 。 CRY2は、青色光刺激によりCIBNに結合し、CRY2 / CIBNタンパク質複合体は暗所で自発的に解離する。青色光は、CRY2補因子、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を励起し、これはCRY2の構造変化およびその後のCIBNへの結合をもたらす。 CRY2 ^W374A突然変異体は光とは無関係にCIBNに結合するが、CRY2 ^D387A突然変異体は青色下でCIBNに結合しないが、CRY2の構成的に活性な（W374A）突然変異体およびフラビン欠損（D387A）突然変異体は、軽い刺激^36,37 。私が記述した光発生系このプロトコールは、野生型CRY2およびCIBNを用いて、生存細胞におけるタンパク質転位置媒介性Raf1活性化を誘導する。 Raf1の膜動員がその活性を増強することが知られている³⁸ 。このシステムでは、タンデムCIBNモジュールが原形質膜に固定され、CRY2-mCherryがRaf1 ^35の N末端に融合される。青色光が存在しない場合、CRY2-mCherry-Raf1は細胞質にとどまり、Raf1は不活性である。青色光刺激は、CRY2-CIBN結合を誘導し、Raf1が活性化される原形質膜にRaf1を動員する。 Raf活性化は、Raf / MEK / ERKシグナル伝達カスケードを刺激する。 CRY2-およびCIBN-融合タンパク質の両方は、バイシストロン性の遺伝子系においてコードされる。この戦略は、Aktのような他のキナーゼを制御するために一般化することができ、その活性化状態は細胞³⁹内のタンパク質転座によってもターンオンすることができる。この研究は、哺乳動物細胞培養におけるこの光発生戦略を実施するための詳細なプロトコールを提示するresおよび多細胞生物である。