Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda inducida por linfocitos T de Myc en peces cebra

El ensayo población lado capitaliza en la capacidad mejorada de ciertas células dentro de un tejido a flujo de salida el colorante de unión a ADN Hoechst 33342 debido a los altos niveles de la casete de unión a ATP (ABC) transportador de proteínas en la membrana celular. Las células que eflujo el colorante Hoechst 33342 se pueden identificar utilizando análisis de citometría de flujo dual de longitud de onda después de que el colorante es excitado por un láser UV. Este ensayo se utilizó primero para identificar células murinas madre hematopoyéticas (HSCs) ^1, pero desde entonces se ha usado para identificar poblaciones de células madre / progenitoras en muchos tejidos y tipos de cáncer (revisado en la referencia 2). Sin embargo, no todas las poblaciones de células tienen una población lado, y no todas las poblaciones laterales están enriquecidas en células madre / progenitoras.

El pez cebra es un poderoso sistema modelo para el estudio genético de los vertebrados cáncer humano ^{3, 4,} con una serie de ventajas sobre mo tradicional murinadels de cáncer. Embriones de pez cebra son fertilizados externamente y son ópticamente transparentes, lo que facilita la transgénesis y la observación in vivo de procesos patológicos, incluyendo la iniciación y progresión del cáncer. Hasta la fecha, el ensayo población lado para detectar potenciales células madre o progenitoras sólo se ha aplicado a la médula renal en el pez cebra para identificar HSCs, y no a cualquier modelos de cáncer de pez cebra ^{5, 6.}

El modelo de pez cebra de las células T de la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) es morfológica y genéticamente similares a humano T-ALL ^{7, 8, 11.} T-ALL es una neoplasia agresiva que, en los seres humanos, representa el 10-15% de los pediátricos y el 25% de los casos de LLA de adultos ^9. Mientras que el tratamiento de la LLA-T ha mejorado, la recaída es todavía común y se asocia con un mal pronóstico. T-ALL tumores son hétérogèneY contienen muchas subpoblaciones de células tumorales diferentes, incluyendo células iniciadoras de leucemia (LICs). Los LIC se definen por su capacidad para regenerar el tumor entero a partir de una sola célula y la frecuencia de LIC dentro de una población de células tumorales se puede calcular trasplantando dosis de células variables en receptores a través de un ensayo de trasplante de dilución limitante (LDA). Mientras que los experimentos de LDA se han realizado en el pez cebra para calcular la frecuencia de los LIC ^{8 , 10 , 11} , esta determinación se hace en retrospectiva y no permite el aislamiento prospectivo de LICs. Por lo tanto, falta un método para aislar prospectivamente una población enriquecida para la actividad de células madre de cáncer. Identificar y aislar las células de la población lateral de pez cebra T-ALLs es el primer paso para abordar esta deficiencia.

El protocolo presentado aquí describe cómo generar eficientemente tumores T-ALL en zebrafish la utilización de transgénesis Tol2 mediada, cosechar las Todas Las células tumorales, y manchar con Hoechst 33342 para identificar la población lado de las células. Future en experimentos in vivo con el pez cebra T-ALL podría incluir si las células de población lateral están enriquecidos para los PRB o tienen otras propiedades stem- o progenitoras-similares.