Isolatie van de side population in Myc-geïnduceerde T-cel acute lymfatische leukemie in zebravis
Summary
Hier beschrijven we een techniek om de zijkant populatie cellen te isoleren uit een zebravis model van myc-geïnduceerde T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL). Deze side population test is zeer gevoelig en beschreven voor zebravis T-ALL, maar kan toepasbaar zijn op andere maligne en niet-maligne types zebravis cel.
Abstract
Heterogene celpopulaties, afkomstig van gezonde en kwaadaardige weefsels, kan een celpopulatie gekenmerkt door een differentiële vermogen om de DNA-bindende kleurstof Hoechst 33342. Deze "side population" cellen uitstroming bevatten kunnen worden geïdentificeerd met behulp flowcytometrische werkwijzen na de Hoechst 33342 kleurstof wordt geëxciteerd door een ultraviolet (UV) laser. De side population van vele soorten cellen bevat stam- of voorlopercellen-achtige cellen. Echter, niet alle celtypen hebben een identificeerbare side population. Danio rerio, zebravis, hebben een robuust in vivo model van T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL), maar of deze zebravis T lekbakken hebben een side population is onbekend. De hier beschreven methode beschreven hoe opzij populatie cellen in de zebravis T-ALL isoleren. Om te beginnen, wordt de T-ALL in de zebravis gegenereerd via microinjectie van tol2 plasmiden in een cel embryo's. Zodra de tumoren gegroeid tot een stadium waarin zij breiden tot meer dan de helft van de animal lichaam, kan de T-ALL-cellen worden geoogst. De cellen worden vervolgens gekleurd met Hoechst 33342 en onderzocht met behulp van flow cytometrie side population cellen. Deze methode heeft brede toepassingen in de zebravis T-ALL onderzoek. Hoewel er geen bekende celoppervlak markers in de zebravis die bevestigen of deze bijwerkingen populatie cellen kankercellen zijn stamcelachtige in vivo transplantatie functionele assays mogelijk. Bovendien kan eencellig transcriptomics worden toegepast op de genetische kenmerken van deze bijwerkingen populatie cellen te identificeren.
Introduction
De zijpopulatie analyse maakt gebruik van het verbeterde vermogen van bepaalde cellen in een weefsel om de DNA bindende kleurstof Hoechst 33342 uit te vloeien als gevolg van hoge niveaus van de ATP bindende cassette (ABC) transporteur eiwitten op het celmembraan. De cellen die de Hoechst 33342-kleurstof uitstromen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van dual-wavelengte-cytometrische analyse nadat de kleurstof opgewonden is door een UV-laser. Deze test werd eerst gebruikt om muizen hematopoietische stamcellen (HSCs) 1 te identificeren, maar is sindsdien gebruikt om stam- / stamcellenpopulaties in veel weefsels en kanker te identificeren (in referentie 2 onderzocht). Echter, niet alle populaties van cellen hebben een zijpopulatie, en niet alle zijpopulaties zijn verrijkt voor stam- / stamcellen.
De zebravis is een krachtig vertebrat genetisch model systeem voor het bestuderen van menselijke kanker 3 , 4 , met een aantal voordelen boven de traditionele murine moDelen van kanker. Zebravis embryo's zijn extern bevrucht en zijn optisch duidelijk, het faciliteren van transgenese en de in vivo waarneming van pathologische processen, waaronder kankerinitiatie en progressie. Tot op heden is de zijkampbevestiging om potentiële stam- of stamcellen te detecteren alleen toegepast op de niermerg in zebravis om HSC's te identificeren, en niet voor zebraviskankermodellen 5 , 6 .
Het zebravismodel van T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) is morfologisch en genetisch vergelijkbaar met de menselijke T-ALL 7 , 8 , 11 . T-ALL is een agressieve maligniteit die bij mensen 10-15% van de pediatrische en 25% van de volwassen ALLE gevallen 9 vertegenwoordigt. Terwijl de behandeling van T-ALL is verbeterd, is de terugval nog steeds gebruikelijk en wordt er gepaard gegaan met een slechte prognose. T-ALL tumoren zijn heterogeenOus en bevatten veel verschillende tumorcel subpopulaties, waaronder leukemie initiatiefcellen (LIC's). LIC's worden gedefinieerd door hun vermogen om de gehele tumor van een enkele cel te hergroeien en de frequentie van LIC's binnen een tumorcelpopulatie kan worden berekend door verschillende celdoses in recipiënten te transplanteren via een limietverdunningstransplantatie-analyse (LDA). Terwijl LDA-experimenten zijn uitgevoerd in zebravis om de frequentie van LICs 8 , 10 , 11 te berekenen, wordt deze bepaling achteraf gemaakt en staat de toekomstige isolatie van LIC's niet toe. Daarom ontbreekt een methode voor het prospectief isoleren van een populatie verrijkt voor kankercellen. Het identificeren en isoleren van bevolkingscellen van zebravis T-ALL's is de eerste stap om deze tekort aan te pakken.
Het hier beschreven protocol beschrijft hoe T-ALL tumoren efficiënt kunnen worden genereerd in zebrVerdovende gebruik maken van tol2-gemedieerde transgenese, oogst de T-ALL tumorencellen, en vlek ze met Hoechst 33342 om de zijbevolking van cellen te identificeren. Toekomstige in vivo experimenten met zebravis T-ALL kunnen omvatten of de zijbevolkingscellen verrijkt zijn voor LIC's of andere stam- of stamvaderachtige eigenschappen hebben.
Protocol
Representative Results
Discussion
De zijbevolkingsassay is zeer gevoelig; Daarom kunnen kleine wijzigingen in het protocol leiden tot problemen bij het detecteren van zijbevolkingscellen. Ten eerste is de temperatuur tijdens de kleuringstap specifiek voor elk dier / celsysteem. Voor zoogdier systemen wordt de zijkantbevolkingsassay typisch uitgevoerd bij 37 ° C2. Wanneer de zebravis T-ALL-cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C, sterven veel van de cellen, waardoor deze incubatietemperatuur onaanvaardbaar was (data niet getoond). Toen Kobayashi en colle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het College van Vrouwen van de Universiteit van Chicago, het Wendy Will Case Fund, en de Universiteit van Chicago Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30 CA014599). We willen de Flow Cytometry Core aan de Universiteit van Chicago bedanken voor hun hulp bij het opzetten van dit experiment, evenals andere leden van de de Jong Lab, met name Leslie Pedraza en Sean McConnell.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
