Isolering av sidebefolkningen i Myc-indusert T-celle akutt lymfoblastisk leukemi i sebrafisk
Summary
Her beskriver vi en teknikk for å isolere de sidepopulasjonsceller fra en sebrafisk modell av myc-indusert T-celle akutt lymfoblastisk leukemi (T-ALL). Denne side befolkning analysen er meget følsom, og er beskrevet for sebrafisk T-ALL, men det kan anvendes på andre maligne og ikke-maligne celletyper sebrafisk.
Abstract
Heterogene cellepopulasjoner, fra enten sunt eller ondartet vev, kan inneholde en populasjon av celler karakterisert ved en differensiell evne til å utflyte det DNA-bindende fargestoffet Hoechst 33342. Denne "sidepopulationen" av celler kan identifiseres ved hjelp av strømningscytometriske metoder etter Hoechst 33342 Fargestoff er begeistret av en ultrafiolett (UV) laser. Sidepopulasjonen av mange celletyper inneholder stam- eller stamcellerlignende celler. Ikke alle celletyper har imidlertid en identifiserbar sidepopulasjon. Danio rerio , zebrafish, har en robust in vivo modell av T-celle akutt lymfoblastisk leukemi (T-ALL), men om disse Zebrafish T-ALLene har en sidepopulasjon, er det ikke kjent. Metoden som beskrives her, beskriver hvordan man isolerer sidepopulasjonscellene i zebrafisk T-ALL. For å starte, genereres T-ALL i sebrafisk via mikroinjeksjon av tol2 plasmider i embryoer med en celle-fase. Når svulstene har vokst til et stadium hvor de utvides til mer enn halvparten av aniMal's kropp, kan T-ALL-cellene høstes. Cellene blir deretter farget med Hoechst 33342 og undersøkt ved hjelp av flytcytometri for sidepopulasjonsceller. Denne metoden har brede anvendelser i Zebrafish T-ALL forskning. Selv om det ikke finnes noen kjente celleoverflate markører i sebrafisk som bekrefter om disse sidestamceller er cancercellestamulignende, er in vivo funksjonelle transplantasjonsanalyser mulig. Videre kan enkeltcelletranscriptomikk brukes for å identifisere de genetiske egenskapene til disse sidebevolkscellene.
Introduction
Sidepopulasjonsassayet kapitaliserer på den forbedrede evne til visse celler i et vev for å utstrømme DNA-bindingsfargen Hoechst 33342 på grunn av høye nivåer av ATP-bindende kassett (ABC) transportørproteiner på cellemembranen. Cellene som utstrømmer Hoechst 33342-fargestoffet kan identifiseres ved bruk av dobbeltbølgelengde-strømningscytometrisk analyse etter at fargestoffet er opphisset av en UV-laser. Denne analysen ble først brukt til å identifisere murine hematopoietiske stamceller (HSCs) 1 , men det har siden blitt brukt til å identifisere stamceller / stamcellepopulasjoner i mange vev og kreft (vurdert i referanse 2). Imidlertid har ikke alle populasjoner av celler en sidepopulasjon, og ikke alle sidepopulasjoner er beriket for stamme / stamceller.
Zebrafish er et kraftig vertebrat genetisk modell system for å studere menneske kreft 3 , 4 , med en rekke fordeler over tradisjonelle murine moDel av kreft. Sebrafiskembryoer er eksternt befruktet og er optisk klare, letter transgenese og in vivo observasjon av patologiske prosesser, inkludert kreftinitiering og progresjon. Hittil har sidebestemmelsesanalysen for å oppdage potensielle stamceller eller stamceller kun blitt brukt på nyremarven i sebrafisk for å identifisere HSCs, og ikke til noen sebrafisk kreftmodeller 5 , 6 .
Zebrafish-modellen av T-celle akutt lymfoblastisk leukemi (T-ALL) er morfologisk og genetisk lik human T-ALL 7 , 8 , 11 . T-ALL er en aggressiv malignitet som i mennesker står for 10-15% av barn og 25% av voksne ALL-tilfeller 9 . Mens behandlingen av T-ALL har forbedret, er tilbakefall fortsatt vanlig og er forbundet med en dårlig prognose. T-ALL-svulster er heterogeneous og inneholder mange forskjellige tumorcellepopulasjoner, inkludert leukemi-initierende celler (Lics). Lics er definert ved deres evne til å vokse hele svulsten fra en enkelt celle, og frekvensen av Lics innenfor en tumorcellepopulasjon kan beregnes ved å transplantere forskjellige celle doser til mottakere via en begrensende fortynning transplantasjon assay (LDA). Mens LDA eksperimenter er blitt utført i sebrafisk for å beregne hyppigheten av Lics 8, 10, 11, er denne bestemmelse laget i ettertid, og gir ikke rom for den potensielle isolering av Lics. Derfor kan en metode for å isolere en populasjon prospektivt anriket for kreftstamcelle aktivitet mangler. Identifisering og isolering av sidepopulasjonsceller fra sebrafisk T-alls er det første skritt i retning av å ta opp denne mangel.
Protokollen presenteres her beskriver hvordan du effektivt generere T-ALL svulster i zebrafish utnytte tol2-mediert transgenesis, høste T-ALL-celler svulster, og beis dem med Hoechst 33342 for å identifisere den side populasjon av celler. Future in vivo eksperimenter med sebrafisk T-ALL kan omfatte om side befolknings cellene er beriket for Lics eller har andre stem- eller progenitor-lignende egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den side befolkning analysen er meget følsom; Derfor kan små endringer i protokollen resultere i vanskeligheter ved påvisning av sidepopulasjonsceller. For det første er den temperatur under fargingstrinn som er spesifikt for hvert dyr / cellesystem. For pattedyrsystemer, er side populasjonen analysen typisk utført ved 37 ° C 2. Når sebrafisk T-ALL-celler ble inkubert ved 37 ° C, mange av cellene døde, noe som gjorde denne inkubasjonstemperaturen uakseptabelt (data ikke vist). Når Kobay…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av University of Chicago kvinner styret, Wendy Will sak Fund, og University of Chicago Comprehensive Cancer Centre Support Grant (P30 CA014599). Vi ønsker å takke flowcytometrisystemer Kjerne ved University of Chicago for deres hjelp i å sette opp dette forsøket, og i tillegg til andre medlemmer av de Jong lab, særlig Leslie Pedraza og Sean McConnell.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
