神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

1.ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）の拡大注：hiPSCsは、mTeSR1 5xサプリメント（製造業者の説明書に従って調製;プレート〜100コロニーフラグメント/ 60mmペトリ皿）を含むmTeSR1培地の存在下で、適切なタンパク質混合基質上で培養することができる。 hiPSCコロニーが適切な大きさに達したら（ 図2Aのコロニーの例を参照）、下記のように細胞を通過させる（1週間に1回）。 hESC認定の基底膜マトリックス（以下、「修飾マトリックス」と呼ぶ）または他の適切なタンパク質基質を含むコートディッシュ。 冷たい1.5 mLチューブと冷たい5または10 mLピペットで、-80°Cで200μLのアリコートで資化マトリックス（材料表を参照 ） を保管します。 継代する前に、氷上で修飾されたマトリックス200μLを解凍する。 20mで修飾されたマトリックス200μLを希釈するLのDMEM / F12培地（1：100希釈）。 この溶液（5mL /ディッシュ）で60mmペトリ皿をコートする。 コーティングした皿を37℃で少なくとも1時間インキュベートする。 HiPSCコロニー断片の凍結保存および融解 hiPSCコロニーを切断した後（hiPSCコロニー切断手順についてはステップ1.3を参照）、幹細胞凍結培地中のhiPSCコロニー断片を〜100断片/250μL（表の表を参照）に静かにゆっくりと再懸濁する。 凍結保存（250μL/バイアル）のための適切なバイアル中のコロニー断片をアリコート。 バイアルを2-プロパノールで満たした容器に入れ、最低2時間、最大2週間、容器を-80°Cに置きます。 バイアルを液体窒素タンクの気相に移す。 培養を再開するために、1凍結バイアルを37℃の水浴中で解凍する。 7mlの予熱した完全なhiPSC中のhiPSCコロニーフラグメントを静かに収集する培地（ 表の表を参照 ）を1 mL、2 mL、5 mLのピペットを使用して15 mLチューブに入れます。 hiPSCコロニー断片を130xgで3分間遠心分離する。 上清を除去し、1,2または5 mLのピペットを使用して、完全なhiPSC培地1 mLでhiPSCコロニーの断片を静かに再懸濁します。 3または4mLの完全なhiPSC培地中で細胞懸濁液をさらに希釈する。 hiPSCコロニーの断片を、資格を与えられたマトリックスコートされた60mmペトリ皿（約100断片/皿;ステップ1.1に記載されているように皿にコートする）にプレーティングする。 37℃および5％CO 2で hiPSCをインキュベートする。 毎日全面的に中程度の変更を行います。 hiPSCコロニーの継代 注：分化していないhiPSCは、大きな核小体および豊富な細胞質を伴わずに、円形でなければならない。未分化のコロニーは、フラットでしっかりとした形態で特徴づけられるべきである。未分化のコロニー（約1mm in直径）をさらに継代するために切断しなければならない。 30G針またはその他の市販ツールを使用した1 mLシリンジを使用して、約200μmx 200μmの四角で幹細胞コロニーを切断します（表の表を参照）。室温で層流キャビネットで倍率4倍の立体顕微鏡を使用する。 皿表面からコロニーの断片を200μLのピペットを用いてゆっくりとピペットで培地をピペットで取り出し、ピースを持ち上げます。 コロニーフラグメント（〜100個）を完全なhiPSC培地（表1.1参照）の4 mLを満たした資格を与えられたマトリックス-DMEM / F12被覆プレートに移す（ステップ1.1に記載のように皿をコートする）。 新しいプレートを37°Cおよび5％CO 2でインキュベートする。 毎日全培地の交換を行い、4倍および10倍の倍率で位相差顕微鏡を用いてコロニーの形態を検査する。 2. HiPSC Differe混合ニューロンとグリアへのネイティエーション注記：この手順には、 図1 （上段）に概説されている主要な手順を実行するのに約28日かかります。 図1：ニューロン分化プロトコルの概略図。 （上部）IMR90-hiPSCコロニーを断片に切断して胚様体（EB）を形成することができる。 インビトロで 2日後（DIV）、EBをラミニンまたは標準マトリックス被覆ディッシュ上にプレーティングし、神経上皮誘導（NRI）培地の存在下で培養して、神経外胚葉誘導体（ロゼット、ここではネスチン（緑色）およびβ -III-チューブリン（赤色））。ロゼットは、解離し、収集し、ラミニンまたは標準マトリックス被覆ディッシュ上に再プレーティングし、さらに成熟ニューロン（NF200、赤）およびグリアニューロン分化（ND）培地の存在下で、細胞（GFAP、緑色）細胞に導入した。 （下部）ローゼット由来NSC（ネスチン、レッド）は、神経誘導（NI）培地の存在下で増殖させ、凍結保存し、またはND培地の存在下でさらに分化させて混合ニューロン（NF200、緑色）およびグリアGFAP、赤色）培養物。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 胚様体（EB）の生成（0日目→1日目） 注：この手順では、手作業のスキルと精度が必要です。 HiPSCコロニー断片は、次の段階で同種の胚様体（EB）を得るために同じ大きさでなければならない。形態学的に分化したコロニー（大きな細胞質画分および小さな核小体を有する）は廃棄すべきである。 未分化hiPSCコロニーを切断する前に、hiPSC培地（3mL / 60mmペトリ皿）をリフレッシュする（直径約1mmeter、 図2A参照）を用いて（ステップ1に記載されているように）滅菌した。 30Gの針を備えた1mLシリンジを用いて未分化のコロニーを（ 図2Aおよび図2Bに示すように ）約200μm×200μmの断片に切断する。室温で層流キャビネットで4倍の倍率で立体顕微鏡を使用する。 皿表面からコロニーの断片を200μLのピペットを用いてゆっくりとピペットで培地をピペットで取り出し、ピースを持ち上げます。 1、2、または5 mLのピペットを使用して、すべての分離フラグメントと培地を15 mLチューブに移す。 全ての断片を回収するために、2mLの完全なhiPSC培地で皿をすすぐ。 112xgで1分間遠心分離する。 上清を吸引し、完全なhiPSC EB培地（ 表の表を参照 ）5 mLに断片を静かに再懸濁する。 共同でプレーする60mmの超低付着性ペトリ皿（5mL / 60mmペトリ皿）中に入れた。 ペトリ皿を37℃、5％CO 2で一晩インキュベートする。 翌日（1日目）に、1,2または5 mLのピペットを使用して15 mLチューブにEBとその培地を集める。 EBを1分間112xgで遠心分離する。 慎重に上清を吸引し、1 mL、2 mL、5 mLのピペットを用いて5 mLの完全なhiPSC EB培地にEBを静かに再懸濁する。 EBを新しい60 mm超低付着ペトリ皿（5 mL / 60 mmペトリ皿）に交換します。 ペトリ皿を37℃、5％CO 2で一晩インキュベートする。 1日目に、基底膜マトリックス（ 例えば、 「標準マトリックス」と称するマトリゲル）または他の適切なタンパク質基質（ 例えば 、ラミニン）で皿を覆う。 -80℃で標準マトリックス（材料表を参照 ）を冷たい1.5mLチューブおよび冷たい5または10mLピペットを使用して200μLのアリコートを添加する。 氷上で200μLの標準マトリックスを解凍する。 20mLのDMEM / F12培地（1：100希釈）に200μLの標準マトリックスを希釈する。 この溶液（5mL /ディッシュ）で60mmペトリ皿をコートする。 コーティングした皿を37℃で一晩インキュベートする。 注：これらの料理は、EB（約50 EBs /料理）をプレートし、神経上皮骨材（ロゼット）を生成するために使用されます。ステップ2.3を参照してください。 神経上皮凝集体（ロゼット）の発生（2→7日目） 2日目に、60-mmペトリ皿から標準マトリックスコーティング溶液を除去し（プレートをすすぐ必要はない）、5mL /ディッシュの完全神経上皮誘導培地（NRI）で満たす。材料の表を参照してください。 ステレオスコピックmiの下で200μLのピペットを使用して、フローティングEB（ステップ2.1.14から）をコーティングされたディッシュ（〜50 EB /ディッシュ）に移す。4倍に拡大し、層流キャビネットに入れた。 注：均質で中程度のEB（直径200〜300μm）を選択することが重要です。小さすぎるEBは神経外胚葉分化の間にうまく生き残ることができず、大きすぎるEBは中核壊死を起こす傾向がある。 37℃および5％CO 2で皿をインキュベートする。 翌日（3日目）に、10倍の倍率で顕微鏡下の皿をチェックし、EBが全て付着していることを確認する。 完全なNRI培地で全培地交換を静かに行う。 神経上皮凝集塊（ロゼット）が目に見えるようになる日まで、NRI培地を1日おきに交換する。 7日目に、ステップ2.2に記載されているように、96ウェルプレート（100μL/ウェル）、24ウェルプレート（250μL/ウェル）、12ウェルプレートウェルプレート（500μL/ウェル）、MEAチップ（電気活性用、1mL /シングルウェルチップ）、または60mmペトリディッシュs（4mL /ディッシュ）。 37℃および5％CO 2で少なくとも2時間、コーティングされたプレート/ディッシュをインキュベートする。 ロゼットの解離とニューロンの分化（8日目→28日目） 注：この手順では、手作業のスキルと精度が必要です。中胚葉および内胚葉細胞の収集を回避するために、外胚葉ロゼット様構造のみを解離させて収集する必要がある。 8日目に、滅菌条件下で10倍の倍率で立体顕微鏡下でロゼット様構造を断片に切断する。 30Gの針を備えた1mLシリンジを使用します。ロゼットは、針で触れたときに皿から容易に外れる傾向があることに留意されたい。 200μLピペットを用いてロゼット断片の分離を完了する。 皿を層流フードの下に移し、1,2または5mLピペットを用いてロゼット断片およびその培地を15mLコニカルチューブに集める。 2mLのNRI培地で皿をすすいで回収するすべての断片。 ロゼット断片を112 xgで2分間回転させます。 上清を吸引する。 1x DPBS（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）の1mLにペレットを静かに再懸濁し、ローゼット断片を上下に1,000μLのピペットで上下にピペットで静かにピペットで分ける。 4 mLの完全NRI培地を加え、トリパンブルーと自動細胞カウンターを用いて細胞数を数えます（ 表の表を参照 ） 注：20μLの細胞懸濁液を20μLのトリパンブルーで希釈します。細胞を単一細胞懸濁液にすることができない場合、この工程は省略してもよい。ロゼット断片が完全に解離していないと思われる場合、約50個のEB / 60-mmディッシュに由来するロゼット断片を、50mlの完全NRI培地に再懸濁し、 表1に示すようにプレーティングすることができる。 ペトリ皿、プレート、および/またはMEAチップから標準マトリックス（またはラミニン）コーティング溶液を吸引します（ステップ2.3。7）。彼らは乾かさないでください。 試験計画に従って細胞を完全NRI培地にプレーティングする（約15,000細胞/ cm 2 ;メッキ量指示については表1を参照）。 37℃および5％CO 2で一晩プレートをインキュベートする。 10日目に、完全ニューロン分化培地（ND）を用いて全培地交換を行う。材料の表を参照してください。 完全ND培地を週に2回、28日目までリフレッシュする。 ステップ5（一般的な受容基準については表2を参照）に記載されているように、ニューロン/グリア細胞誘導体を特徴づける。 3. HiPSC由来の神経幹細胞（NSC）の拡大と混合ニューロンとグリアへの分化注：ロゼット断片由来のNSCは、以下に説明する手順（ 図1 、下部）に従って、拡大して維持することができる。これにより、分化および化学試験のための細胞数。 標準マトリックスDMEM / F12コーティング溶液5 mLを含む60 mmペトリ皿（またはT-25フラスコ）をコートし、37℃および5％CO 2で少なくとも2時間インキュベートする（2.2項に記載）。 ステップ1-2（ステップ2.4を参照）から得られたロゼットフラグメントを、円錐形の15mL管内で112xgで2分間スピンダウンする。 静かに5mLの神経誘導培地（NI）にペレットを再懸濁する。材料の表を参照してください。 細胞を標準的なマトリックス被覆60 mmペトリ皿（またはT-25フラスコ）に移す。 培養ロゼット由来NSCをNI培地の存在下で培養し、細胞がコンフルエンスに達するまで一日おきに培地をリフレッシュする。 コンフルエントになったら、以下の手順にしたがってNSCを継代する。 注：NSCを一週間に1回通過する。研究計画に応じて、新しくコートした皿、フラスコ、またはプレートを使用することを検討してください。 完全なNIメディアとgentlを削除するDPBS（カルシウムとマグネシウムを含まない）でNSCをすすぐ。 細胞が入っている60-mmのペトリ皿（またはT-25フラスコ）に37℃に予熱した0.05％トリプシン-EDTA 1.5 mLを添加し、インキュベーターに1分間入れる。 皿（またはフラスコ）を静かにタップして細胞を剥がす。 37℃に予熱した1.5mLのトリプシンインヒビターを添加し、細胞を15mLチューブに移す。 同じ容量のNI培地（1.5mL）でペトリ皿（またはT-25フラスコ）をすすぎ、同じ15mLチューブに容量を集める。 細胞を130xgで3分間遠心分離する。 上清を除去し、1000μLピペットを使用して完全なNI培地1mLに細胞を静かに再懸濁する。 さらに、3または4mLの完全NI培地で細胞懸濁液を希釈し、トリパンブルーおよび自動細胞計数器を用いて細胞を計数する。 NSCをステップ3.1の60mmペトリ皿（またはT-25フラスコ）上に約50,000細胞/ cm 2の密度でプレートする。 <li> 1日おきに完全なNI媒体を使用して完全に媒体を交換します。 ステップ5で説明したように、ニューロン/グリア細胞誘導体の存在について細胞を特徴づける。 注：完全なND培地（ステップ2.4.11-2.4.13に記載）でNSCをニューロンとグリアの混合培養に分化させ、完全なND培地を週に2回、21日間爽やかにすることができる。 4. HiPSC由来のNSC凍結保存および融解注：継代に際して、NSCはこの手順に従って凍結して再解凍することができる。 130xgで3分間継代した継代したNSC（ステップ3.12から）。 注：セルは、ステップ3.14でカウントする必要があります。 静かにゆっくりと3×10 6 / mLの凍結培地でNSCを再懸濁する（ 表の表を参照 ）。 凍結保存のために適切なバイアルに細胞を分注する（約0.5mL = 1.5×10 6 /バイアル）。 バイアルを容器に入れる。fi2-プロパノールで洗浄し、最低2時間、最高2週間、容器を-80℃に置く。 バイアルを液体窒素タンクの気相に移す。 細胞培養を再開するには、1凍結バイアルを37℃の水浴で解凍します。 1000μLのピペットを使用して、15mLチューブ中の予め温めた完全NI培地7mL中に細胞を静かに集める。 細胞を130xgで3分間遠心分離する。 上清を除去し、1,000μLピペットを使用して完全なNI培地1mLに細胞を静かに再懸濁する。 さらに3または4mLの完全NI培地で細胞懸濁液を希釈し、トリパンブルーおよび自動細胞計数器を用いて細胞を計数する（注：トリパンブルー20μL中の細胞懸濁液20μLを希釈する;解凍後の生存率は80以上であるべきである） ％）。 コーティングされた60mmペトリ皿（またはT25フラスコ）に、約50,000細胞/ cm 2の密度でNSCをプレートする。 5.キャラhiPSC由来ニューロンおよびグリア細胞の核形成注：分化の際に、ニューロンおよびグリア誘導体は、以下のセクションで説明するような異なる技術を用いて特徴付けることができる。 定量的リアルタイムPCR（qPCR）は、 10 hiPSCコロニーフラグメント、EB、および/またはNSCを130xgで3分間スピンダウンする。 RNA抽出に適したキットに入っている冷RNA溶解バッファー100μLに細胞ペレットを再懸濁します。 あるいは、培地を吸引し、ウェルに低温RNA溶解緩衝液を加えて細胞を収集することにより、プレートから神経細胞/グリア誘導体を直接収集する。 製造者の指示に従ってRNAを単離する。 RNAからcDNAへの逆転写に適したキットを用いて500ngの全RNAを逆転写する。 適切なマスターミックスおよびプライマーを使用して、qPCR反応を二重に実行する。セット（材料表を参照 ）。 蛍光発光をリアルタイムで記録する：60℃でアニーリングするプライマーを用いて45サイクル。 相対RNA量を参照遺伝子としてGAPDHおよびβ-アクチンに標準化し、較正条件（ΔΔCt法）のために未分化hiPSCまたは未処理細胞を使用する。あるいは、別の適切な方法を使用してください。 免疫細胞化学および高含有イメージング（HCI）6,11 冷たい4％パラホルムアルデヒドでhiPSCコロニー、NSCおよび/またはニューロン/グリア誘導体を室温で15分間固定する。 1X PBSで細胞を静かに洗浄し、4℃でプレートを1ヶ月間保存する。 染色の準備ができたら、室温で15分間透過性緩衝液（0.1％トリトン-X-100および3％BSAを含有する1×DPBS）中で細胞を透過処理する。 透過処理を取り除く細胞をブロッキング緩衝液（3％BSA / 1×DPBS）中で室温で15分間インキュベートして、抗体の非特異的結合を防止する。 ブロッキングバッファーを除去し、細胞を一晩4℃でインキュベートする。適切な一次抗体を含むブロッキングバッファー（ 表の表を参照 ）。 1×PBSで細胞を3回洗浄する。 蛍光色素結合二次抗体（ 表の表を参照 ）を含むブロッキングバッファー中で室温で45分間細胞をインキュベートし、核をDAPI色素で対比染色する。 利用可能であれば、適切なハイコンテントイメージングプラットフォームを使用して、平均蛍光強度および細胞タイプの相対百分率を定量する（ 表の表を参照 ）。 注意：蛍光バックグラウンドの強度レベルを決定するために、いくつかの細胞/ウェルを二次抗体単独でインキュベートする。ライブ（固定されていない）およびフローサイトメトリー分析SSC4のようなPSC特異的マーカーの発現を評価するために、過剰のhiPSCを実施することができる（ 表の表を参照 ）。市販のBCIP / NBTキットを使用して、製造業者の指示に従って、未分化hiPSCコロニーをアルカリホスファターゼ活性について分析することができる（ 表の表を参照 ）。さらに、文献12（試験された抗体の一覧については、 表の表を参照 ）に記載されているように、逆相タンパク質アレイ（RPPA）アッセイおよび分析を行うことができる。 電気生理学的測定13 完全なND培地（約1×10 5個の細胞/単一ウェルMEAチップ）中の解離したロゼット断片（7 DIV後）またはコーティングした多電極アレイ（MEA; 表の表を参照 ）上のロゼットに由来するNSC をプレートする 。 完全なND培地で3週間細胞を分化させ、1週間に2回、 分化の最後に、層流フードの下で半透膜でMEAチップを密封し、繰り返し測定するために培養液を無菌状態に保つ。 電極の1つを1つのグランド基準に置き換え、残りの電極からの記録を可能にする。 37℃と5％CO 2に調整された温度プロセス制御を内蔵したMEAアンプを使用して、平均発火率（MFR;スパイク数/分）を記録する。 -4.7σ（σは基底ノイズの標準偏差を表す）の限界値を使用して、MEA生データからピークを検出します。 適切なソフトウェアでポストレコーディングデータを処理する。