Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) sont considérées comme un outil puissant pour le dépistage médicamenteux et chimique et pour le développement de nouveaux modèles in vitro pour les tests de toxicité, y compris la neurotoxicité. Ici, un protocole détaillé pour la différenciation des hiPSC dans les neurones et la glie est décrit.
Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent se différencier en divers types cellulaires qui peuvent être appliqués à des essais de toxicité in vitro à base humaine. Un avantage majeur est que la reprogrammation des cellules somatiques pour produire des cellules souches pluripotentes induites par l'homme (HPSP) évite les problèmes éthiques et législatifs liés à l'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines (HESC). Les HiPSC peuvent être étendus et efficacement différenciés en différents types de cellules neuronales et gliales, servant de systèmes d'essai pour les tests de toxicité et, en particulier, pour l'évaluation des différentes voies impliquées dans la neurotoxicité. Ce travail décrit un protocole pour la différenciation des hiPSC en cultures mixtes de cellules neuronales et gliales. Les voies de signalisation qui sont régulées et / ou activées par la différenciation neuronale sont définies. Cette information est essentielle à l'application du modèle cellulaire au nouveau paradigme de test de toxicité, dans lequel les produits chimiques sont évalués en fonction de leur capacité à utiliserRturb des voies biologiques. En tant que preuve de concept, le rotenone, un inhibiteur du complexe respiratoire mitochondrial I, a été utilisé pour évaluer l'activation de la voie de signalisation Nrf2, un régulateur clé du mécanisme anti-oxydant-réponse-élément- (ARE) de défense cellulaire contre le stress oxydatif .
Le rapport du Conseil national de recherches des États-Unis 1 prévoyait un nouveau paradigme de test de toxicité dans lequel les tests de toxicité réglementaire seraient déplacés d'une approche s'appuyant sur les changements phénotypiques observés chez les animaux à une approche axée sur des essais mécanistes in vitro utilisant des cellules humaines. Les dérivés de cellules souches pluripotentes (PSC) peuvent représenter des alternatives aux modèles de cellules cancéreuses, car les cellules obtenues peuvent ressembler davantage aux conditions physiologiques des tissus humains et fournir des outils plus pertinents pour étudier les effets indésirables induits par les produits chimiques. Les deux principaux types de cultures de PSC qui sont les plus prometteurs pour les tests de toxicité sont les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (HiPSC), actuellement largement utilisées dans les domaines de la recherche fondamentale et de la médecine régénératrice 2 , 3 . Cette expertise peut maintenant être exploitée pour le développement d'une nouvelle classe de toxinoTests in vitro in vitro visant à identifier les voies physiologiques perturbées impliquées dans le développement d'effets indésirables in vivo . Cependant, tous les États membres de l'UE et les pays du monde pourraient accepter les méthodes d'essai pour les évaluations de sécurité réglementaires basées sur des problèmes d'éthique et diverses politiques législatives nationales régissant l'utilisation de cellules dérivées d'embryons.
Les hiPSCs partagent des caractéristiques similaires aux HESC 4 , 5 et possèdent un grand potentiel pour les méthodes in vitro , à la fois pour identifier les cibles thérapeutiques, ainsi que pour les évaluations de sécurité. En outre, la technologie HiPSC atténue les contraintes d'un pool de donneurs limité et les préoccupations éthiques associées aux cellules dérivées d'embryons. Un défi majeur pour les hiPSCs est la démonstration que ces cellules peuvent générer de manière reproductible une gamme significative de dérivations cellulaires toxicologiquement pertinentes,Avec des caractéristiques et des réponses typiques des tissus humains. Les niveaux prédéfinis des marqueurs sélectionnés sont généralement utilisés pour caractériser les populations cellulaires après le processus de différenciation et pour donner une idée de la stabilité du processus de différenciation.
Des travaux antérieurs ont évalué la pertinence des hiPSC pour générer des cultures mixtes de cellules neuronales et gliales et pour évaluer les effets de la roténone, un inhibiteur du complexe respiratoire mitochondrial I, sur l'activation de la voie Nrf2, un régulateur clé des mécanismes de défense anti-oxydants dans Plusieurs types de cellules 6 , 7 .
Ce travail décrit un protocole utilisé pour la différenciation des hiPSC dans les cultures neuronales et gliales mixtes, fournissant des détails sur les voies de signalisation (niveau des gènes et des protéines) qui sont activés lors de la différenciation neuronale / gliale. En outre, le travail montre des résultats représentatifs démontrant comment celaLe modèle de cellules neuronales et gliaques dérivé de HiPSC peut être utilisé pour évaluer l'activation de la signalisation Nrf2 induite par un traitement aigu (24 h) avec de la rotenone, permettant l'évaluation de l'induction du stress oxydatif.
Les fibroblastes IMR90 ont été reprogrammés dans les hiPSC à I-Stem (France) par la transduction virale de 2 facteurs de transcription (Oct4 et Sox2) en utilisant des vecteurs pMIG 6 . Des modèles hiPSC analogues peuvent également être appliqués. Les protocoles décrits ci-dessous résument tous les stades de la différenciation des hiPSC dans les cellules souches neurales (NSC) et encore dans les cultures mixtes des neurones post-mitotiques et des cellules gliales (étapes 1 et 2, voir également le site EURL ECVAM DBALM pour une description détaillée de Le protocole) 8 .
Un protocole supplémentaire pour l'isolement, l'expansion, la cryoconservation et la différenciation supplémentaire des NSC dans les neurones mixtes et les cellules gliales est détaillé aux étapes 3 et 4 (référence également à l'EURL ECVAM DBALM nousBsite pour une description détaillée de ce protocole) 9 . L'étape 5 décrit les analyses qui peuvent être faites pour évaluer l'identité phénotypique des cellules au cours des différentes étapes de l'engagement et de la différenciation.
Ce travail décrit un protocole robuste et relativement rapide pour la différenciation des IMR90-hiPSC en neurones post-mitotiques et cellules gliales. Les protocoles de différenciation neuronale précédemment publiés basés sur les hESC et les hiPSCs donnent généralement des pourcentages élevés de précurseurs neuronaux 25 , 26 et un nombre significatif de cellules cibles neuronales 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Par analogie, le protocole de différenciation décrit ici est approprié pour générer des cultures hétérogènes de cellules neuronales GABAergiques, glutamatérgiques et dopaminergiques, ainsi que la glie et une proportion discrète de cellules Nestin + . La présence de cellules neuronales glutamatérgiques (~ 35-42%) et GABAergiques (~ 15-20%) suggère queCette culture possède le cerveau antérieur, les caractéristiques corticales et la présence d'un nombre discret de neurones dopaminergiques (~ 13-20%) peut également indiquer une spécificité du cerveau moyen. En outre, la permanence d'une modeste proportion de cellules nestin + peut s'avérer appropriée pour l'étude de la neurogénèse et les effets possibles des produits chimiques sur les NSC, qui se limitent principalement à l'hippocampe et à la zone subventriculaire (SVZ) du cerveau antérieur 34 . D'autres analyses immunocytochimiques et d'expression des gènes aideraient à mieux définir la spécificité régionale des dérivés cellulaires différenciés.
Les deux étapes les plus critiques du protocole de différenciation décrites dans ce document sont: (i) la coupe des colonies hiPSC en fragments homogènes (qui est critique pour la génération d'EB avec des tailles homogènes) et (ii) la coupe des structures neuroectodermiques (rosettes ) Pour la différenciation NSC, qui nécessite une compétence manuelle significativeEt une précision pour éviter de collecter des cellules mésodermiques et endodermiques qui peuvent réduire les proportions de neurones et de cellules gliales obtenues lors de la différenciation.
Il est crucial de caractériser les phénotypes des cellules pendant l'expansion (en tant que colonies indifférenciées ou NSC) et pendant toutes les étapes de différenciation. En particulier, les profils d'expression de gènes et de protéines des dérivés des cellules neuronales et gliales devraient présenter une régulation et une activation des voies de signalisation liées aux neurones, alors que l'expression des marqueurs de pluripotence devrait être diminuée.
La génération d'EB et de dérivés neuroectodermiques (rosettes) peut être difficile à l'emploi et susceptible d'être modifiée. Pour cette raison, nous avons développé un protocole pour l'expansion des NSC dérivés de la rosette et leur différenciation supplémentaire en cellules neuronales / gliales.
Les limites possibles de ce protocole de différenciation sont principalement (i) le pourcentage relativement faible de dDérivés de glie inférentielle et (ii) le manque de fonctions de réseau neuronal matures (comme le montre le manque de rafales). En outre, des sous-populations spécifiques d'astrocytes peuvent fonctionner comme progéniteurs primaires ou NSC 35 . Bien que les cellules double-positives de nestin / GFAP n'aient pas été observées dans cette culture cellulaire différenciée (données non présentées), on suppose que les cellules GFAP + dans ces cultures mixtes sont des progéniteurs astrocytaires et des astrocytes. Il est plausible que, en prolongeant le temps de différenciation, le nombre d'astrocytes augmente, et leur morphologie peut devenir plus mature, comme l'ont déjà indiqué les travaux antérieurs du groupe 36 , 37 de Zhang.
Dans le nouveau paradigme de test de toxicité, les connaissances sur les perturbations chimiques des voies biologiques sont de la plus haute importance lors de l'évaluation de l'adversité chimique. Par conséquent, les systèmes de test in vitro devraient pouvoirAssocient des effets indésirables aux perturbations des voies de signalisation, selon la notion de voie de résultat défavorable (AOP). En tant que preuve de concept, la rotenone peut être utilisée pour évaluer l'activation de la voie Nrf2, qui est impliquée dans la défense cellulaire contre le stress oxydatif ou électrophile 38 , et le stress oxydatif est un événement clé important et commun dans différents AOPs pertinents pour Neurotoxicité développementale et adulte 39 .
La Roténone devrait susciter l'activation de la voie Nrf2, qui peut être démontrée par la translocation nucléaire de la protéine Nrf2 et l'expression accrue des enzymes Nrf2-cible, y compris NQO1 et SRXN1. Il a été constaté que la roténone induit une augmentation dose-dépendante des taux de protéines de GFAP, indicatif de l'activation des astrocytes 40 , 41 . La Roténone diminue également le nombre de cellules dopaminergiques (TH + ), en accord avec les préviLes études in vitro et in vivo montrant la mort de la cellule dopaminergique dépendante de rotenone, puisque ce type de neurone est particulièrement sensible au stress oxydatif 21 , 22 , 23 .
En conclusion, ce modèle de culture cellulaire et neurale dérivée de HiPSC est un outil précieux pour évaluer les effets neurotoxiques des produits chimiques qui provoquent un stress oxydatif entraînant une activation de la voie Nrf2. Comme ce protocole de différenciation permet la génération de cultures mixtes de cellules neuronales (neurones GABAergiques, dopaminergiques et glutamatérgiques) et astrocytes, il peut s'avérer approprié d'étudier la diaphonie entre les neurones et la glie dans des conditions physiologiques et pathologiques telles que dans les maladies neurodégénératives ( Par exemple, la maladie de Parkinson). En outre, la présence d'une proportion significative de NSC peut aider à évaluer les effets possibles des produits chimiques sur le programme neuralQui sont connus pour être la cible principale de mutations chimiquement induites ou d'infections virales 42 .
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs souhaitent remercier le Dr Marc Peschanski (I-Stem, Évry, France), pour la fourniture des IMR90-hiPSC; Dr. Giovanna Lazzari et Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italie); Dr. Simone Haupt (Université de Bonn, Allemagne); Dr. Tiziana Santini (Institut Italien de Technologie, Rome), pour fournir des conseils sur l'évaluation de la coloration par immunofluorescence; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo et Dr. Luca Persano (Université de Padoue, Italie), pour leurs contributions à l'analyse RPPA et à la validation des anticorps. Financement: ce travail a été soutenu par le projet financé par l'UE "SCR & Tox" (Accord de subvention N ° 266753).
Complete hiPSC medium: | |||
mTeSR1 Basal Medium | Stem Cell Technologies | 05851 | (Step 1.2.6). Complete mTeSR1 is stable when stored at 2 – 8°C for up to 2 weeks. 5X Supplements can be dispensed into working aliquots and stored at -20°C. Use frozen aliquots within 3 months. |
mTeSR1 5X Supplements | Stem Cell Technologies | 05852 | |
Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | 1:100 (Step 1.1). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 ul aliquots and store them in -80°C. For coating, dilute 200ul aliquot in 20 ml of DMEM/F12 medium. |
CryoStem Freezing Medium | Stemgent | 01-0013-50 | Freeze ~ 100 fragments/250 ul/vial (Step 1.2.1) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
hiPSC EB medium: | |||
Knockout DMEM | Thermo-Fisher | 10829-018 | (Step 2.1.7) |
Knockout Serum Replacement (KOSR) | Thermo-Fisher | 10828-028 | 20% final concentration (Step 2.1.7) |
Non-Essential Amino Acids | Thermo-Fisher | 11140-035 | (Step 2.1.7) |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 2.1.7) |
L-Glutamine 200 mM Solution | Thermo-Fisher | 25030-081 | 2 mM final concentration (Step 2.1.7) |
β-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 31350-010 | 50 µM final concentration (Step 2.1.7) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Complete neuroepithelial induction medium (NRI): | |||
DMEM/F12 | Thermo-Fisher | 3133-038 | (Step 2.3.1) |
Non-Essential Amino Acids | Thermo-Fisher | 11140-035 | (Step 2.3.1) |
N2 Supplement | Thermo-Fisher | 17502-048 | (Step 2.3.1) |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 2.3.1) |
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg | Sigma-Aldrich | H3149-100KU | 2 µg/ml final concentration (Step 2.3.1) |
bFGF | Thermo-Fisher | 13256-029 | 20 ng/ml final concentration added before use (Step 2.3.1) |
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | 1:100 (Step 2.2). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 ul aliquots and store them in -80°C. For coating, dilute 200 ul aliquot in 20 ml of cold DMEM/F12 medium. |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 1:100 (Step 2.2). Dilute in PBS 1X. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Complete Neuronal Differentiation medium (ND): | |||
Neurobasal Medium | Thermo-Fisher | 21103049 | (Step 2.4.11) |
B-27 Supplements (50x) | Thermo-Fisher | 17504044 | (Step 2.4.11) |
N2 Supplement | Thermo-Fisher | 17502-048 | (Step 2.4.11) |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 2.4.11) |
GDNF | Thermo-Fisher | PHC7045 | 1 ng/ml final concentration. Added before use. (Step 2.4.11) |
BDNF | Thermo-Fisher | PHC7074 | 2.5 ng/ml final concentration. Added before use. (Step 2.4.11) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neural induction medium (NI): | |||
DMEM/F12 | Thermo-Fisher | 3133-038 | (Step 3.3) |
Non-Essential Amino Acids | Thermo-Fisher | 11140-035 | (Step 3.3) |
N2 Supplement | Thermo-Fisher | 17502-048 | (Step 3.3) |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 3.3) |
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg | Sigma-Aldrich | H3149-100KU | 2 µg/ml final concentration (Step 3.3) |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo-Fisher | 12587010 | (Step 3.3) |
L-Glutamine 200 mM Solution | Thermo-Fisher | 25030-081 | 2 mM final concentration (Step 3.3) |
bFGF | Thermo-Fisher | 13256-029 | 10 ng/ml final concentration. Added before use (Step 3.3) |
EGF | Thermo-Fisher | PHG6045 | 10 ng/ml final concentration. Added before use (Step 3.3) |
BDNF | Thermo-Fisher | PHC7074 | 2.5 ng/ml final concentration. Added before use (Step 3.3) |
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Thermo-Fisher | R007-100 | Pre-warm at 37°C. Add an equal amount of DTI to Trypsin-EDTA (Step 3.10) |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo-Fisher | 15400054 | 1:10. Dilute Trypsin-EDTA in PBS 1x (without calcium and magnesium), pre-warm the solution at 37°C (Step 3.8) |
CryoStor cell cryopreservation medium | Sigma-Aldrich | C2874-100ML | (Step 4.2) |
Trypan Blue (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | multiple manufacturers/suppliers |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
TaqMan Probesets and reagents for gene expression analysis: | |||
RNAqueous-Micro kit | Thermo-Fisher | AM1931 | (Step 5.1.6) |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits | Thermo-Fisher | 4368814 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo-Fisher | 4369016 | |
GFAP | Thermo-Fisher | Hs00909233_m1 | |
MAP2 | Thermo-Fisher | Hs00258900_m1 | |
NQO1 | Thermo-Fisher | Hs02512143_s1 | |
SRXN1 | Thermo-Fisher | Hs00607800_m1 | |
HMOX1 | Thermo-Fisher | Hs01110250_m1 | |
GSR | Thermo-Fisher | Hs00167317_m1 | |
PAX6 | Thermo-Fisher | Hs01088112_m1 | |
NES | Thermo-Fisher | Hs00707120_s1 | |
GRIA1 | Thermo-Fisher | Hs00181348_m1 | |
GAP43 | Thermo-Fisher | Hs00967138_m1 | |
GABRA3 | Thermo-Fisher | Hs00968132_m1 | |
GABRA1 | Thermo-Fisher | Hs00168058_m1 | |
NR4A2 | Thermo-Fisher | Hs00428691_m1 | |
TH | Thermo-Fisher | Hs00165941_m1 | |
GAPDH | Thermo-Fisher | Hs02758991_g1 | |
ACTB | Thermo-Fisher | Hs99999903_m1 | |
MAPT | Thermo-Fisher | Hs00902194_m1 | |
SYP | Thermo-Fisher | Hs00300531_m1 | |
NANOG | Thermo-Fisher | Hs04260366_g1 | |
POU5F1 (OCT4) | Thermo-Fisher | Hs04195369_s1 | |
SOX1 | Thermo-Fisher | Hs01057642_s1 | |
AFP | Thermo-Fisher | Hs00173490_m1 | |
KRT18 | Thermo-Fisher | Hs01941416_g1 | |
NPPA | Thermo-Fisher | Hs00383230_g1 | |
T | Thermo-Fisher | Hs00610080_m1 | |
NCAM1 | Thermo-Fisher | Hs00941821_m1 | |
NR4A1 | Thermo-Fisher | Hs00374226_m1 | |
PHOX2A | Thermo-Fisher | Hs00605931_mH | |
PHOX2B | Thermo-Fisher | Hs00243679_m1 | |
NARG2 | Thermo-Fisher | Hs00973298_g1 | |
SLC18A3 | Thermo-Fisher | Hs00268179_s1 | |
SLC5A7 | Thermo-Fisher | Hs00222367_m1 | |
ISL1 | Thermo-Fisher | Hs00158126_m1 | |
LHX3 | Thermo-Fisher | Hs01033412_m1 | |
TaqMan Human Protein Kinase Array | Thermo-Fisher | 4418721 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies and reagents for immunostaining: | |||
B-III-tubulin (Tuj1) | Covance | MMS-435P | 1:500 (Step 5.2.5). Other antibodies may also be used. |
MAP2 | Sigma Aldrich | M4403 | 1:500 |
NF200 | Sigma Aldrich | N4142 | 1:1000 |
GFAP | Acris Antibodies GmbH | AP02002SU-N | 1:500 |
Nestin | Sigma-Aldrich | N5413 | 1:200 |
synaptophysin (SYN) | Abcam | AB14692 | 1:200 |
Tau | Thermo-Fisher | MA5-12808 | 1:100 |
Nrf2 | Abcam | AB62352 | 1:200 |
Keap1 | Abcam | AB66620 | 1:200 |
sulfiredoxin1 (SRXN1) | Abcam | AB92298 | 1:200 |
NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) | Abcam | AB2346 | 1:200 |
OCT4 | Millipore | MAB4401 | 1:100 |
SSEA3 | Millipore | MAB4303 | 1:100 |
Tra1-60 | Millipore | MAB4360 | 1:250 |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | 1:200 |
Gamma-aminobutyric acid (GABA) | Sigma-Aldrich | A0310 | 1:100 |
Vesicular glutamate transporter 1 (VGlut1) | Abcam | AB72311 | 1:500 |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | 4% (4% formaldehyde can also be used) |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fisher | 14190144 | |
Triton-X-100 Solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | 0.1% |
BSA 35% | Sigma-Aldrich | A7979-50ML | 3.5% |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594 conjugate | Thermo-Fisher | SA5-10040 | 1:500. (Step 5.2.7) Other fluorochrome-conjugated secondary antibodies may also be used. In this case, appropriate dilutions should be tested by the enduser. |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate | Thermo-Fisher | SA5-10166 | 1:500 |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate | Thermo-Fisher | SA5-10086 | 1:500 |
DAPI Solution (1 mg/ml) | Thermo-Fisher | 62248 | 1:1000 (Step 5.2.7) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies for Reverse Phase Protein Array (RPPA): | |||
4E-BP1 (S65) | Abcam | AB81297 | 1:250 (Note after step 5.2.8) |
Akt (T308) | Cell Signaling | 9275 | 1:100 |
Akt (S473) | Cell Signaling | 9271 | 1:100 |
AMPKalpha (T172) | Cell Signaling | 2531 | 1:100 |
AMPKbeta1 (S108) | Cell Signaling | 4181 | 1:100 |
ATF-2 (T71) | Cell Signaling | 9221 | 1:100 |
c-Jun (S63) | Cell Signaling | 9261 | 1:200 |
c-Jun (S73) | Cell Signaling | 9164 | 1:200 |
c-Kit (Y719) | Cell Signaling | 3391 | 1:250 |
CREB (S133) | Cell Signaling | 9191 | 1:100 |
EGFR (Y1068) | Cell Signaling | 2234 | 1:50 |
ErbB2/HER2 (Y1248) | Cell Signaling | 2247 | 1:100 |
ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204) | Cell Signaling | 9101 | 1:2000 |
GSK-3alpha (S21) | Cell Signaling | 9337 | 1:50 |
Jak1 (Y1022/1023) | Cell Signaling | 3331 | 1:100 |
Lck (Y505) | Cell Signaling | 2751 | 1:500 |
LKB1 (S428) | Cell Signaling | 3051 | 1:100 |
mTOR (S2448) | Cell Signaling | 5536 | 1:100 |
NFkB p65 (S536) | Cell Signaling | 3031 | 1:50 |
p70 S6 Kinase (T389) | Cell Signaling | 9205 | 1:200 |
PDK1 (S241) | Cell Signaling | 3061 | 1:100 |
PKA C (T197) | Cell Signaling | 4781 | 1:250 |
PRAS40 (T246) | BioSource | 44-1100 | 1:2000 |
PTEN (S380) | Cell Signaling | 9551 | 1:500 |
Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428) | Cell Signaling | 9511 | 1:500 |
Src (Y527) | Cell Signaling | 2105 | 1:500 |
Src Family (Y416) | Cell Signaling | 2101 | 1:200 |
Stat1 (Y701) | Cell Signaling | 9171 | 1:200 |
Stat3 (S727) | Cell Signaling | 9134 | 1:200 |
Zap-70 (Y319) | Enogene | E011159 | 1:100 |
βCatenin (S33/37/T41) | Cell Signaling | 9561 | 1:250 |
CREB | Upstate Biotechnologies | 06-863 | 1:100 |
Fos B | Cell Signaling | 2251 | 1:200 |
GRB2 | Cell Signaling | 3972 | 1:2000 |
HSP70 | Stressgen | SPA-810 | 1:100 |
c-Jun | Cell Signaling | 9165 | 1:100 |
Kip1/p27 | BD | 610241 | 1:100 |
Lck | Cell Signaling | 2984 | 1:250 |
Mcl-1 | Cell Signaling | 4572 | 1:80 |
Musashi | Cell Signaling | 2154 | 1:100 |
NOTCH1 | Cell Signaling | 3439 | 1:100 |
PTEN | Cell Signaling | 9552 | 1:500 |
SGK1 | Abnova | PAB4590 | 1:250 |
Zap-70 | Cell Signaling | 2705 | 1:250 |
β-Catenin | Abcam | AB32572 | 1:1000 |
Dll4 | Abcam | AB7280 | 1:500 |
Shh | Abcam | AB53281 | 1:250 |
HIF-1α | BD | 610958 | 1:50 |
NUMB PAN-ISO | Upstate Biotechnologies | 07-207 | 1:400 |
NUMB-L | Chemicon | AB15145 | 1:750 |
Cyclin B | BD | 610220 | 1:75 |
c-Myc | Calbiochem | OP-10 | 1:100 |
BCIP/NBT Kit | Thermo-Fisher | 002209 | (Note after step 5.2.8). Kit used to measure alkaline phosphatase activity, similar kits can be used. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies for Flow Cytometry: | |||
SSEA1 Antibody, Pacific Blue conjugate | Thermo-Fisher | MHCD1528 | 1:100 (Note after step 5.2.8) |
SSEA4 Antibody (MC813-70), Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | SSEA421 | 1:100 |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Specific instruments, tools and softwares: | |||
Countess Automated Cell Counter | Thermo-Fisher | C10227 | Neubauer chamber or other suitable glass hemocytometer can be used. |
MEA1060-Inv-BC | Multichannel Systems | MEA1060-Inv-BC | (Step 5.3) |
MEA1060-BC control software | Multichannel Systems | MEA1060-BC | (Step 5.3) |
NeuroExplorer | Multichannel Systems | NeuroExplorer (NE) | (Step 5.3) For post-processing of MEA data |
Multielectrode arrays (MEA) | Multichannel Systems | 60MEA100/10iR-Ti-gr | (Step 5.3) Single-well MEA chip |
ArrayScan XTI High Content Platform | Thermo-Fisher | ASN00002P | (Step 5.2.8) Mean fluorescence can be quantified by using specific ArrayScan algorithms (e.g., Cytotoxicity V.4 and NucTrans V.4 bioapplications). It is recommended to take minimum 20 pictures/well, and have 7-8 internal replicates per condition |
7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo-Fisher | 4351405 | (Step 5.1.6) |
BD ULTRA-FINE Needle Insulin Syringe (with 30G needle) | BD | 328280 | (Steps 1.3.1, 2.1.2, and 2.4.1) |
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | ThermoFisher | 23181010 | This colony cutting tool can be used as an alternative to the use of 30G needle 1 mL syringes (Step 1.3.1) |
Ultra-Low attachment Petri dish (60 mm) | Corning | 10010582 | (Step 2.1.8) Also other brands can be used. |
Mr. Frosty Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562-1EA |