Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l'immunoprecipitazione cromatina
Summary
Le interazioni tra proteine del DNA sono essenziali per processi biologici multipli. Durante la valutazione delle funzioni cellulari, l'analisi delle interazioni tra proteine del DNA è indispensabile per comprendere la regolazione del gene. L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è un potente strumento per analizzare in vivo tali interazioni .
Abstract
Molti processi cellulari, compresa la replicazione e la riparazione del DNA, la ricombinazione del DNA e l'espressione genica, richiedono interazioni tra proteine e DNA. Pertanto, le interazioni proteine del DNA regolano molteplici funzioni fisiologiche, patofisiologiche e biologiche, come la differenziazione cellulare, la proliferazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la stabilità del cromosoma, la regolazione epigenetica dei geni e la trasformazione cellulare. Nelle cellule eucariotiche, il DNA interagisce con proteine istone e non-istone e viene condensato in cromatina. Diversi strumenti tecnici possono essere utilizzati per analizzare le interazioni tra proteine del DNA, come l'EMSS (Electrophoresis (Gel)) e DNase I (footprinting). Tuttavia, queste tecniche analizzano l'interazione proteina-DNA in vitro , non all'interno del contesto cellulare. L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è una tecnica che cattura le proteine nei loro siti specifici di legame del DNA, consentendo così l'identificazione dell'interazione tra proteine del DNAAll'interno del loro contesto cromatico. Viene fatta con la fissazione dell'interazione tra proteine del DNA, seguita da immunoprecipitazione della proteina di interesse. Successivamente, si caratterizza il sito genomico cui è legata la proteina. Qui descriviamo e discutiamo il ChIP e dimostriamo il suo valore analitico per l'identificazione del legame di trasformazione Factor-β (TGF-β) del fattore di trascrizione SMAD2 a SMAD Binding Elements (SBE) all'interno della regione promotore della tirosina- Proteina chinasi Kit (c-KIT) del recettore del fattore cellule staminali (SCF).
Introduction
Nel nucleo degli eucarioti, il DNA interagisce con proteine dell'istone e proteine non-istone ed è condensato in cromatina. Nel contesto fisiologico, patofisiologico e biologico delle cellule, le funzioni cellulari sono controllate spazialmente e temporaneamente dall'espressione genica coordinata con cromatina. Le interazioni tra proteine del DNA hanno un ruolo essenziale nella regolazione dei processi cellulari, come la replicazione del DNA, la ricombinazione e la riparazione, così come l'espressione di proteine. Pertanto, l'analisi delle interazioni tra proteine del DNA è uno strumento indispensabile nella valutazione dell'espressione genica e della funzione cellulare.
Esistono diverse tecniche per valutare le interazioni proteiche del DNA in vitro , come l'EMPE (Electrophoresis (Gel)) e DNase I footprinting 1 , 2 . Tuttavia, queste tecniche non analizzano l'interazione proteina-DNA all'interno del contesto cromatina e cellulare. ChIP iTecnica che cattura le proteine legate ai loro specifici siti di legame del DNA e quindi facilita l'identificazione delle interazioni tra proteine del DNA all'interno del contesto cromatico. La tecnica è stata originariamente sviluppata da Gimour e Lis per la valutazione della RNA polimerasi II legata a geni specifici in Escherichia coli e Drosophila melanogaster 3 , 4 . Viene effettuata mediante la fissazione dei complessi proteici del DNA, seguita dall'estrazione di cromatina e tagliando il DNA in frammenti di 200 paia di base (bp). Successivamente, la proteina di interesse legata al DNA viene isolata mediante immunoprecipitazione. Dopo l'inversione del DNA-protein crosslink, il DNA viene purificato e analizzato. Diversi metodi possono essere utilizzati per l'analisi dei siti di legame delle proteine e dipendono dalla sequenza di acido nucleico del sito di legame della proteina all'interno del gene bersaglio 5 . Nei casi in cui è nota la sequenza del DNA, standard PolPossono essere applicate reazioni a catena ymerase (PCR), utilizzando coppie di primer specifiche che fiancheggiano il noto sito di legame. È possibile utilizzare anche il PCR quantitativo in tempo reale (qRT-PCR) 6 . Nei casi in cui la sequenza è sconosciuta, ChIP può essere combinato con microarray di DNA (ChIP-on-chip), sequenza di DNA (ChIP-seq) o tecniche di clonazione 7 , 8 , 9 .
Il percorso TGF-β ha potenti funzioni di soppressione del tumore ed è un percorso chiave nella differenziazione cellulare. Viene attivato attraverso il legame del legante TGF-β1 al suo complesso recettore cognato, con conseguente fosforilazione della serina dei fattori di trascrizione SMAD2 / 3. Dopo la loro associazione con il mediatore comune, SMAD4, il complesso SMAD trasloca al nucleo e si lega all'SBE all'interno della regione promotore dei geni bersaglio, dove regola i geni che controllano il ciclo cellulare, l'apoptosi e le cellule differenziatesopra. La risposta trascrizionale alla stimolazione TGF-β è tipologia di cellule e contesto-specifico 10 . Recentemente abbiamo descritto un ciclo di feedback positivo tra TGF-β e il percorso c-KIT 11 . In questo modello, SMAD2 attivato da TGF-β1 si lega al promotore di ligandi del c-KIT e induce la sua espressione e secrezione. Successivamente, il ligando c-KIT attiva il recettore c-KIT in modo auto- e para-crinico. L'attivazione del recettore del c-KIT determina la presenza di STAT3 Tyr 705- fosforilazione tramite JAK1 / 2. A seguito dell'attivazione STAT3 e della traslocazione nucleare, STAT3 si lega al gene ligand TGF-β1 e regola la sua espressione.
Qui dimostriamo il ruolo essenziale dell'analisi ChIP per l'identificazione della legame SMAD2 al promotore del ligando del recettore c-KIT e per l'identificazione del trasduttore del segnale (e) attivatore (di) della trascrizione 3 (legame STAT3 al TGF-β1- gene).
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto dimostriamo il legame di SMAD2 indotto da TGF-β1 a un SBE all'interno del promotore di ligandi del c-KIT e del legame di STAT3 indotto da TGF-β1 alla sua sequenza di riconoscimento all'interno del gene ligand TGF-β1. Abbiamo dimostrato la legame di entrambi i fattori di trascrizione con citocina indotta da immunoprecipitazione cromatina.
L'immunoprecipitazione di cromatina è un potente strumento per dimostrare il legame diretto di una proteina di interesse …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Università del Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (fondi di avvio, BB).
Materials
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
References
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26 (1), 37-47 (2002).
- Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).
- Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).
- Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94 (5), 585-594 (1998).
- Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).
- Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).
- Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).
