Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation
Summary
DNA-Protein-Wechselwirkungen sind für mehrere biologische Prozesse essentiell. Bei der Auswertung von zellulären Funktionen ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen unentbehrlich für das Verständnis der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein mächtiges Werkzeug, um solche Wechselwirkungen in vivo zu analysieren .
Abstract
Mehrere zelluläre Prozesse, einschließlich DNA-Replikation und Reparatur, DNA-Rekombination und Genexpression, erfordern Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA. Daher regeln DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrere physiologische, pathophysiologische und biologische Funktionen wie Zelldifferenzierung, Zellproliferation, Zellzykluskontrolle, Chromosomenstabilität, epigenetische Genregulation und Zelltransformation. In eukaryotischen Zellen interagiert die DNA mit Histon- und Nonhiston-Proteinen und wird zu Chromatin kondensiert. Mehrere technische Werkzeuge können verwendet werden, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu analysieren, wie die Elektrophorese (Gel) Mobility Shift Assay (EMSA) und DNase I Footprinting. Diese Techniken analysieren jedoch die Protein-DNA-Interaktion in vitro , nicht im zellulären Kontext. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine Technik, die Proteine an ihren spezifischen DNA-Bindungsstellen einfängt, wodurch die Identifizierung der DNA-Protein-Wechselwirkung ermöglicht wirdS in ihrem Chromatin-Kontext. Es erfolgt durch Fixierung der DNA-Protein-Wechselwirkung, gefolgt von einer Immunopräzipitation des Proteins von Interesse. Anschließend wurde die genomische Stelle, an der das Protein gebunden war, charakterisiert. Hier beschreiben und diskutieren wir ChIP und zeigen ihren analytischen Wert für die Identifizierung der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) -induzierten Bindung des Transkriptionsfaktors SMAD2 an SMAD Bindungselemente (SBE) innerhalb der Promotorregion des Tyrosin- Proteinkinase-Kit (c-KIT) -Rezeptorligand Stammzellfaktor (SCF).
Introduction
Im Nukleus von Eukaryoten interagiert DNA mit Histonproteinen und nonhistonischen Proteinen und wird zu Chromatin kondensiert. Im physiologischen, pathophysiologischen und zellbiologischen Kontext werden zelluläre Funktionen räumlich und zeitweise durch chromatin-koordinierte Genexpression kontrolliert. DNA-Protein-Wechselwirkungen haben eine wesentliche Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen wie DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur sowie Protein-Expression. Daher ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen ein unentbehrliches Werkzeug bei der Bewertung von Genexpression und Zellfunktion.
Es gibt mehrere Techniken zur Beurteilung von DNA-Protein-Wechselwirkungen in vitro , wie der Elektrophorese (Gel) Mobility Shift Assay (EMSA) und DNase I Footprinting 1 , 2 . Diese Techniken analysieren jedoch nicht die Protein-DNA-Wechselwirkung innerhalb des Chromatin- und Zellkontextes. ChIP iSa-Technik, die Proteine, die an ihre spezifischen DNA-Bindungsstellen gebunden sind, erfasst und dadurch die Identifizierung von DNA-Protein-Wechselwirkungen innerhalb des Chromatinkontextes erleichtert. Die Technik wurde ursprünglich von Gimour und Lis für die Beurteilung der RNA-Polymerase II-Bindung an spezifische Gene in Escherichia coli und Drosophila melanogaster 3 , 4 entwickelt . Es wird durch Fixierung der DNA-Protein-Komplexe durchgeführt, gefolgt von der Durchführung der Chromatingextraktion und der Scherung der DNA in ~ 200 Basenpaar (bp) Fragmente. Anschließend wird das DNA-gebundene Protein von Interesse durch Immunpräzipitation isoliert. Nach der Umkehrung der DNA-Protein-Vernetzung wird die DNA gereinigt und analysiert. Für die Analyse der Proteinbindungsstellen können mehrere Methoden angewendet werden, die von der Nukleinsäuresequenz der Proteinbindungsstelle innerhalb des Zielgens 5 abhängen. In Fällen, in denen die DNA-Sequenz bekannt ist, ist Standard PolYmerase Kettenreaktionen (PCR) können angewendet werden, wobei spezifische Primerpaare, die die bekannte Bindungsstelle flankieren, angewendet werden. Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) kann auch verwendet werden 6 . In Fällen, in denen die Sequenz unbekannt ist, kann ChIP mit DNA-Mikroarrays (ChIP-on-Chip), DNA-Sequenzierung (ChIP-seq) oder Klonierungstechniken 7 , 8 , 9 kombiniert werden.
Der TGF-β-Weg hat starke Tumorunterdrückungsfunktionen und ist ein Schlüsselweg in der Zelldifferenzierung. Es wird durch die Bindung des TGF-β1-Liganden an seinen kognitiven Rezeptorkomplex aktiviert, was zur Serin-Phosphorylierung von SMAD2 / 3-Transkriptionsfaktoren führt. Nach ihrer Assoziation mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4 verschiebt sich der SMAD-Komplex in den Zellkern und bindet an die SBE innerhalb der Promotorregion der Zielgene, wo er Gene kontrolliert, die den Zellzyklus, die Apoptose und die Zelldifferenzierung kontrollierenauf. Die Transkriptionsreaktion auf die TGF-β-Stimulation ist zelltyp- und kontextspezifisch 10 . In letzter Zeit haben wir eine positive Rückkopplungsschleife zwischen TGF-β und dem c-KIT-Pfad 11 beschrieben . In diesem Modell bindet TGF-β1-aktiviertes SMAD2 an den c-KIT-Liganden-Promotor und induziert seine Expression und Sekretion. Anschließend aktiviert der c-KIT-Ligand den c-KIT-Rezeptor auto- und para-crinisch. Die c-KIT-Rezeptor-Aktivierung führt zu STAT3 Tyr 705 -phosphorylierung über JAK1 / 2. Nach der STAT3-Aktivierung und der nuklearen Translokation bindet STAT3 an das TGF-β1-Liganden-Gen und reguliert seine Expression.
Hier zeigen wir die wesentliche Rolle der ChIP-Analyse zur Identifizierung der SMAD2-Bindung an den c-KIT-Rezeptor-Liganden-Promotor und zur Identifizierung des Signaltransducers (und) Activators (von) Transkription 3 (STAT3-Bindung an die TGF- & bgr; 1- Gen).
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht zeigen wir die TGF-β1-induzierte Bindung von SMAD2 an eine SBE innerhalb des c-KIT-Liganden-Promotors und TGF-β1-induzierte Bindung von STAT3 an seine Erkennungssequenz innerhalb des TGF-β1-Liganden-Gens. Wir zeigen die Cytokin-induzierte Bindung beider Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation.
Chromatin-Immunpräzipitation ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die direkte Bindung eines Proteins von Interesse für DNA zu demonstrieren, u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (Startup Fonds, BB) unterstützt.
Materials
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
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