Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo
Summary
This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.
Abstract
Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.
Introduction
Il cuore è il primo organo funzionale a sviluppare nell'embrione 1, 2. In combinazione con il sistema circolatorio, fornisce l'ossigeno, nutrienti, e un meccanismo di smaltimento durante lo sviluppo. Tre settimane dopo la fecondazione, il cuore umano batte per la prima volta e la sua regolamentazione adeguata è mantenuta da cardiomiociti (CMS). La perdita irreversibile di queste cellule specializzate è quindi la questione fondamentale sottostante insufficienza cardiaca progressiva. Mentre alcuni organismi come zebrafish e Xenopus hanno il potenziale per la rigenerazione cardiaca, cuore adulto dei mammiferi è più limitata 3, 5, 6. Così, data la funzione critica del cuore, non è sorprendente che la malattia di cuore è la principale causa di morte nel mondo, che rappresentano 600.000 morti nel solo 7 negli Stati Uniti. Ilto, è terapie a base di cellule per riparare o sostituire il miocardio danneggiato in modo efficiente sono di grande interesse clinico.
Lo studio fondamentale di Yamanaka e colleghi hanno mostrato che 8 espressione forzata di quattro fattori di trascrizione è sufficiente per convertire i fibroblasti completamente differenziate di cellule staminali pluripotenti. Tuttavia, la capacità tumorigenico di tutte le strategie di cellule staminali pluripotenti è stata una preoccupazione fondamentale per il loro uso per scopi terapeutici. Questo ha motivato il campo scientifico per la ricerca di metodi alternativi per transdifferenziare cellule, evitando uno stadio di pluripotenza. Recentemente, diversi gruppi hanno dimostrato la fattibilità di questa strategia per la visualizzazione di conversione diretta dei fibroblasti di topo a cellule cardiomiociti come indotte (iCLMs) con l'espressione ectopica di fattori di trascrizione Gata4, MEF2C, Tbx5, e più tardi, Hand2 (GMT e GHMT rispettivamente) 9, 10. Furthermore, la stessa strategia può essere eseguita in vivo e in tessuti umani di derivazione 9, 11, 12. Recenti studi hanno evidenziato fattori complementari o vie di segnalazione che possono essere modulati per migliorare ulteriormente l'efficienza riprogrammazione cardiaco 13, 14, 15. Presi insieme, questi studi dimostrano il potenziale di transdifferenziazione diretta per terapie rigenerative. Tuttavia, la scarsa efficienza della riprogrammazione CM, i meccanismi molecolari sconosciuti, riproducibilità incoerente a causa delle differenze metodologiche 16, e la natura eterogenea del iCLMs rimangono senza indirizzo.
Al fine di valutare direttamente iCLM eterogeneità, abbiamo progettato un saggio unicellulare discreto e robusto per l'individuazione di sviluppo sarcomere e cardiaco specificatio lignaggion-due necessarie caratteristiche di cardiomiociti funzionali. Ci sono almeno tre tipi principali di CM nel cuore come definite dalla loro posizione e uniche proprietà elettriche: atriale (AM), ventricolare (VM) e pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. In una combinazione orchestrato, permettono il corretto pompaggio di sangue. Durante la ferita del cuore, uno o tutti i sottotipi potrebbero essere interessati, e il tipo di terapia cellulare dovrebbero essere affrontate caso per caso. Attualmente, la maggior parte delle strategie si concentrano sulla generazione complessiva di cardiomiociti, mentre poco lavoro è stato fatto per studiare i meccanismi molecolari che regola specifica sottotipo.
Il seguente studio dettagli come quantificare correttamente sarcomeri ben organizzati e identificare un insieme diversificato di sottotipi di cardiomiociti. Utilizzando un pacemaker (PM) topo giornalista SPECIFICI, siamo in grado di applicare un iapproccio mmunocytochemical distinguere miociti atriali indotte-like (IAM), miociti ventricolari come indotta (IVM), e indotti miociti PM-like (IPMS) 21. Sulla base delle nostre osservazioni, solo le cellule che presentano l'organizzazione sarcomere sono in grado di battere spontanea. Questa piattaforma unica riprogrammazione permette di valutare il ruolo di alcuni parametri nell'organizzazione sarcomere, specifica sottotipo, e l'efficienza della riprogrammazione CM ad una risoluzione di singola cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente studio fornisce una strategia a riprogrammazione diretta per la conversione di MEF in un insieme diversificato di sottotipi cardiaci tramite espressione retrovirus-mediata della trascrizione cardiaco fattori Gata4, MEF2C, Tbx5, e Hand2 (GHMT). Utilizzando un approccio immunocolorazione multiplex in combinazione con un PM-specifica del mouse giornalista, siamo in grado di identificare iAM, IVMS, e IPMS ad una risoluzione di singola cellula. Tale test permette una sperimentazione in vitro sistema in g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.
Materials
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100um cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45um Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6ml Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10X Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1X in H20 |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH20 |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 ml Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 ml Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
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