تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية قياس بدقة بقاء الخلايا العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات (فدا) والبروبيديوم يوديد (بي) تلطيخ مزدوج في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخ مثقف، ثقافة العصبية الأولية المستخدمة كنموذج في المختبر في علم الأعصاب والبحوث العصبية.
Abstract
المستزرعة الأولية المخيخ الحبيبية وقد استخدمت الخلايا العصبية (كغنز) على نطاق واسع كنموذج في المختبر في علم الأعصاب والبحوث نيوروفارماكولوغي. ومع ذلك، فإن التعايش من الخلايا الدبقية والخلايا العصبية في ثقافة كغن قد يؤدي إلى التحيزات في تقييم دقيق للالسلامة العصبية. وقد استخدمت فلوريسئين دياسيتات (فدا) و بروبيديوم يوديد (بي) تلطيخ مزدوج لقياس بقاء الخلية عن طريق تقييم في وقت واحد الخلايا القابلة للحياة والموت. استخدمنا فدا-بي تلطيخ مزدوج لتحسين حساسيات المقايسات اللونية وتقييم بقاء الخلايا العصبية في كغنز. وعلاوة على ذلك، أضفنا الأزرق البقع الحمض النووي الفلورسنت (على سبيل المثال، هويشت) لتحسين دقة. يصف هذا البروتوكول كيفية تحسين دقة تقييم بقاء الخلايا العصبية باستخدام هذه الأساليب في ثقافة كغن. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن استبعاد عدد من الخلايا الدبقية باستخدام المجهر مضان. ويمكن تطبيق استراتيجية مماثلة لتمييز غلي غير المرغوب فيهاالخلايا العصبية من الخلايا العصبية في مختلف الثقافات الخلية المختلطة، مثل الثقافة القشرية الأولية والثقافة الحصين.
Introduction
وتستخدم مقايسات السمية اللونية، مثل مقايسة البروميد (3، 4 – 5 – ثنائي ميثيل – 2 – ثيازوليل) 2 – 5 – ثنائي فينيل – 2 – H – تيترازوليوم، لقياس بقاء الخلية في المختبر . المستزرع الأولي المخيخ الحبيبية الخلايا العصبية (كغنز) من الفئران حساسة لمختلف السموم العصبية، بما في ذلك 1-ميثيل -4-فينيل بيريدينيوم أيون، بيروكسيد الهيدروجين، والغلوتامات 1 ، 2 . لذلك، يمكن استخدام الثقافات كغن كنموذج في المختبر في مجال علم الأعصاب. قد تحتوي الثقافات كغن على مجموعة متنوعة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، والتي يمكن أن تمثل حوالي 1٪ من مجموع الخلايا في ثقافة كغن. ومع ذلك، تستجيب الخلايا الدبقية بشكل مختلف للسموم العصبية بالمقارنة مع الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى التحيز في بقاء الخلايا العصبية يقاس المقايسات اللونية 3 .
في خلايا قابلة للحياة، فلوريسئين دياسيتات (فدا) يمكن تحويلها إلى فلوريسئين من قبل إستيراس.بروبيديوم يوديد (بي) يمكن أن تتفاعل مع الحمض النووي بعد اختراق الخلايا الميتة ويمكن استخدامها للإشارة إلى موت الخلايا المبرمج داخل الثقافة. لذلك، يمكن فدا-بي تلطيخ مزدوج يمكن تقييم خلايا قابلة للحياة والخلايا الميتة في وقت واحد، مما يشير إلى أن بقاء الخلية يمكن قياسها بشكل أكثر دقة من خلال الجمع بين كل من الأساليب اللونية. وعلاوة على ذلك، عن طريق إضافة هويشت، وصمة عار الفلورسنت الأزرق للنوى، ودقة بقاء الخلية يمكن زيادة تحسين. بروتوكول المعروضة هنا يصف فدا-بي تلطيخ مزدوج و فدا-بي-هويشست تلطيخ الثلاثي، والتي يمكن استخدامها لتحليل بدقة جدوى الخلايا العصبية في كغن مثقف الابتدائي.
هذا البروتوكول يستفيد من تصور والتمييز كغنز والخلايا الدبقية من قبل أحجامها والأشكال المختلفة. بعد تلطيخ، يتم حساب أعداد الخلايا العصبية القابلة للحياة والخلايا العصبية الميتة من الصور التي تم التقاطها من قبل المجهر الفلورسنت. وتستبعد الخلايا الدبقية الكبيرة الحجم بمقارنة نماذج كغن النموذجية tأكين تحت وضع الفلورسنت مع تلك التي اتخذت تحت وضع النقيض المرحلة. ويمكن إجراء استراتيجية مماثلة لقياس بقاء الخلايا العصبية في الخلايا الخلوية المختلطة التي تحتوي على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، مثل الثقافات القشرية الأولية والثقافات الحصين.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تعديل هذا البروتوكول من الإجراءات التي تم وصفها سابقا 6 ، 7 . وقد قضى الباحثون الوقت في محاولة للحد من نمو الخلايا غير العصبية من خلال تحسين الظروف عند زراعة الخلايا العصبية الأولية في المختبر 8 . ومع ذلك، حتى مع تحسن …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ (LY15H310007)، ومشروع البحوث التطبيقية على التكنولوجيا غير الربحية لمقاطعة تشجيانغ (2016C37110)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U1503223، 81673407)، و نينغبو الدولية للعلوم و مشروع التعاون التكنولوجي (2014D10019)، وفريق الابتكار بلدية نينغبو لعلوم الحياة والصحة (2015C110026)، ومشروع التعاون الدولي مقاطعة قوانغدونغ للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2013B051000038)، وبرنامج البحوث الأساسية شنتشن (JCYJ20160331141459373)، وقوانغدونغ هونغ (غب / 012 / 16GD)، ومجلس منح البحوث في هونغ كونغ (15101014)، وجامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية (G-يبغق)، وصندوق كينغ وونغ ماغنا في جامعة نينغبو.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
References
- Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
- Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
- Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
- Labno, C. . Two way to count cells with ImageJ. , (2008).
- Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
- Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
- Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).
