הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד במדויק הכדאיות העצבית באמצעות fluorescein diacetate (FDA) ו Propidium Iodide (PI) מכתים פעמיים בתרבית נוירונים גרגר cerebellar, התרבות העצבית הראשית המשמשת במודל חוץ גופית בתחום מדעי המוח ומחקר neuropharmacology.
Abstract
ראשוני Cerebellar Cranbellar גרגר נוירונים (CGNs) כבר בשימוש נרחב כמודל חוץ גופית בתחום מדעי המוח ו neuropharmacology מחקר. עם זאת, דו קיום של תאים גליה ו נוירונים בתרבות CGN עלול להוביל biases בהערכה מדויקת של הכדאיות העצבית. פלואורסצין diacetate (FDA) ו Propidium יודיד (PI) מכתים פעמיים שימש למדוד הכדאיות התא על ידי הערכה בו זמנית של תאים קיימא ומת. השתמשנו FDA-PI מכתים כפול כדי לשפר את הרגישויות של מבחני colorimetric וכדי להעריך את הכדאיות העצבית CGNs. יתר על כן, הוספנו כתמים דנ"א כחול פלואורסצנטי ( למשל, Hoechst) כדי לשפר את הדיוק. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשפר את הדיוק של הערכה של הכדאיות העצבית באמצעות שיטות אלה בתרבות CGN. באמצעות פרוטוקול זה, מספר תאים גליה ניתן להרחיק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אסטרטגיה דומה ניתן ליישם כדי להבחין בין gli לא רצויאל תאי נוירונים בתרביות תאים מעורבים שונים, כגון תרבות קליפת המוח הראשית ותרבות בהיפוקמפוס.
Introduction
מבחני ציטוטוקסיטי Colorimetric, כגון assay (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT), משמשים בדרך כלל למדוד כדאיות התא במבחנה . ראשוני Cerebellar מתורבת גרעינים נוירונים (CGNs) מחולדות הם רגישים נוירוטוקסים שונים, כולל יון 1-methyl-4-phenylpyridinium, מי חמצן, ו גלוטמט 1 , 2 . לכן, תרבויות CGN יכול לשמש מודל במבחנה בתחום של מדעי המוח. תרבויות CGN יכולות להכיל מגוון של תאים, כולל נוירונים ותאי גלייה, אשר יכולים להסביר כ 1% מכלל התאים בתרבית CGN. עם זאת, תאים גליה להגיב באופן שונה neurotoxins לעומת נוירונים, המוביל הטיה של הכדאיות העצבית נמדדת מבחני colorimetric 3 .
בתאים קיימא, fluorescein diacetate (FDA) ניתן להמיר פלואורסצין על ידי esterase.Propidium יודיד (PI) יכול לתקשר עם ה- DNA לאחר חודר תאים מתים והוא יכול לשמש כדי להצביע אפופטוזיס בתוך התרבות. לכן, מכתים FDA-PI כפול יכול להעריך בו זמנית תאים קיימא תאים מתים, מה שמרמז כי הכדאיות התא ניתן למדוד בצורה מדויקת יותר על ידי שילוב של שתי שיטות colorimetric. יתר על כן, על ידי הוספת Hoechst, כתם פלואורסצנטי כחול עבור גרעינים, את דיוק הכדאיות התא יכול להיות משופר עוד יותר. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר מכתים FDA-PI כפול ו- FDA-PI-Hoechst מכתים משולשת, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לנתח במדויק הכדאיות העצבית CGNs מתורבת העיקרי.
פרוטוקול זה מנצל הדמיה והבחנה CGNs ותאי גלייה על ידי גדלים וצורות שונות שלהם. לאחר מכתים, את המספרים של נוירונים קיימא נוירונים מת נספרים תמונות נציג שנלקחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאי הגלייה הגדולים אינם נכללים על ידי השוואה בין CGNs טיפוסיAken תחת מצב פלורסנט עם אלה שנלקחו במצב ניגודיות שלב. אסטרטגיה דומה ניתן לבצע כדי למדוד הכדאיות העצבית בתרביות תאים מעורבים המכילים נוירונים ותאי גלייה, כגון תרבויות קליפת המוח היסודי ותרבויות בהיפוקמפוס.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה שונה מ הליכים שתוארו בעבר 6 , 7 . חוקרים השקיעו זמן מנסה להפחית את התאים שאינם עצביים תאים על ידי שיפור התנאים כאשר נוירונים העיקרי culturing במבחנה 8 . עם זאת, גם עם תנאי התרבות משופרת, כמה תאים גליה להישאר. יתר על …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של פרובינציית ג'ה-ג'יאנג (LY15H310007), פרויקט המחקר היישומי על טכנולוגיה ללא מטרות רווח של פרובינציית ג'ה-ג'יאנג (2016C37110), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U1503223, 81673407) טכנולוגיה שיתוף פעולה פרויקט (2014D10019), Ningbo החדשנות המקומית של מדעי החיים ובריאות (2015C110026), בפרובינצית גואנגדונג שיתוף פעולה בינלאומי פרויקט המדע והטכנולוגיה (מס '2013B051000038), שנזן יסוד מחקר התוכנית (JCYJ20160331141459373), גואנגדונג הונג הונג קונג (15101014), הונג קונג פוליטכני אוניברסיטת (G-YBGQ), ואת KC וונג Magna קרן באוניברסיטת Ningbo.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
References
- Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
- Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
- Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
- Labno, C. . Two way to count cells with ImageJ. , (2008).
- Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
- Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
- Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).
