Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid met behulp van Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Dubbele Verf In Cerebellaire Granule Neuron Cultuur
Summary
Dit protocol beschrijft hoe om neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te meten met behulp van Fluorescein Diacetate (FDA) en Propidium Iodide (PI) dubbele kleuring in gekweekte cerebellar granule neuronen, een primaire neuronale cultuur die gebruikt wordt als een in vitro model in neurowetenschappen en neurofarmacologie onderzoek.
Abstract
Primaire gekweekte Cerebellar Granule Neuronen (CGN's) zijn veel gebruikt als een in vitro model in neuroscience en neuropharmacology onderzoek. Het co-bestaan van gliale cellen en neuronen in CGN-cultuur kan echter leiden tot vooroordelen bij de nauwkeurige beoordeling van neuronale levensvatbaarheid. Fluoresceendiacetaat (FDA) en Propidiumjodide (PI) dubbele kleuring is gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te meten door de levensvatbare en dode cellen tegelijkertijd te evalueren. We hebben FDA-PI dubbele kleuring gebruikt om de gevoeligheden van de colorimetrische analyses te verbeteren en neuronale levensvatbaarheid in CGN's te evalueren. Verder voegde we blauwe fluorescerende DNA vlekken toe (bijvoorbeeld Hoechst) om de nauwkeurigheid te verbeteren. Dit protocol beschrijft hoe de nauwkeurigheid van de beoordeling van neuronale levensvatbaarheid kan verbeteren door gebruik te maken van deze methoden in de CGN-cultuur. Met behulp van dit protocol kan het aantal gliale cellen uitgesloten worden met behulp van fluorescentiemicroscopie. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om de ongewenste gli te onderscheidenAlcellen van neuronen in verschillende gemengde celculturen, zoals primaire corticale cultuur en hippocampale cultuur.
Introduction
Colorimetrische cytotoxiciteitsbepalingen, zoals de 3- (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide (MTT) -assay, worden gewoonlijk gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen in vitro te meten. Primaire gekweekte Cerebellar Granule Neuronen (CGN's) van ratten zijn gevoelig voor verschillende neurotoxinen, waaronder 1-methyl-4-fenylpyridinium-ion, waterstofperoxide en glutamaat 1 , 2 . Daarom kunnen CGN culturen gebruikt worden als een in vitro model op het gebied van neurowetenschappen. CGN-culturen kunnen een verscheidenheid aan cellen bevatten, waaronder neuronen en gliale cellen, die ongeveer 1% van de totale cellen in de CGN-cultuur kunnen uitmaken. Glialcellen reageren echter verschillend op neurotoxinen in vergelijking met neuronen, wat leidt tot een vooroordeel in de neuronale levensvatbaarheid gemeten door colorimetrische analyses 3 .
In levensvatbare cellen kan fluoresceendiacetaat (FDA) omgezet worden in fluoresceïne door esterase.Propidiumjodide (PI) kan interageren met het DNA na het binnendringen van dode cellen en kan gebruikt worden om apoptose binnen de cultuur aan te geven. Daarom kan FDA-PI dubbele kleuring tegelijkertijd levensvatbare cellen en dode cellen evalueren, wat suggereert dat de cellevendigheid nauwkeuriger kan worden gemeten door beide colorimetrische methoden te combineren. Bovendien, door Hoechst toe te voegen, een blauwe fluorescerende vlek voor kernen, zou de nauwkeurigheid van de cellevendigheid verder kunnen worden verbeterd. Het hier beschreven protocol beschrijft FDA-PI dubbele kleuring en FDA-PI-Hoechst triple staining, die gebruikt kan worden om de neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te analyseren in primaire gekweekte CGN's.
Dit protocol profiteert van het visualiseren en onderscheiden van CGNs en glialcellen door hun verschillende maten en vormen. Na kleuring worden de aantallen levensvatbare neuronen en dode neuronen geteld uit representatieve beelden die worden genomen door fluorescerende microscopie. De grote gliale cellen worden uitgesloten door de vergelijking van typische CGNs tAken onder fluorescerende modus met die welke onder fase contrast modus zijn genomen. Een soortgelijke strategie kan worden uitgevoerd om neuronale levensvatbaarheid in gemengde celculturen te meten die neuronen en gliale cellen bevatten, zoals primaire corticale culturen en hippocampale culturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol werd gewijzigd van procedures die eerder zijn beschreven 6 , 7 . Onderzoekers hebben tijd aan het proberen om de niet-neuronale celgroei te verminderen door de voorwaarden te verbeteren bij het cultiveren van primaire neuronen in vitro 8 . Echter, zelfs bij verbeterde kweekomstandigheden blijven sommige gliale cellen. Bovendien zijn niet-neuronale cellen nodig in primaire neuronale culturen, omdat ze helpen bij neuro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Stichting Natuurwetenschappen van de provincie Zhejiang (LY15H310007), het toegepaste onderzoeksproject inzake non-profit technologie van de provincie Zhejiang (2016C37110), de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (U1503223, 81673407), de Ningbo International Science and Technology Cooperation Project (2014D10019), het Ningbo Municipal Innovation Team van Life Science and Health (2015C110026), het Guangdong Provinciaal Internationaal Samenwerkingsproject van Wetenschap en Technologie (No. 2013B051000038), het Shenzhen Basic Research Programma (JCYJ20160331141459373), de Guangdong-Hong Kong Technology Co-operation Funding Scheme (GHP / 012 / 16GD), de Onderzoeksraad van Hong Kong (15101014), de Hong Kong Polytechnische Universiteit (G-YBGQ) en het KC Wong Magna Fonds aan de Universiteit van Ningbo.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
References
- Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
- Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
- Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
- Labno, C. . Two way to count cells with ImageJ. , (2008).
- Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
- Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
- Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).
