Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии
Summary
Здесь мы описываем полный рабочий процесс для качественного и количественного анализа иммунных синапсов между основной человеческий Т-клеток и антиген представляющих клеток. Метод основан на визуализации проточной цитометрии, который позволяет приобретение и оценки нескольких тысяч клеток изображений в течение относительно короткого периода времени.
Abstract
Иммунная синапса — это область коммуникации между Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР). Т-клетки поляризовывайте поверхности рецепторы и белков к иммунной СИНАПС для обеспечения стабильного привязки и сигнал обмен. Классическая конфокальный, TIRF или суперразрешением микроскопии были использованы для изучения иммунной синапсе. Поскольку эти методы требуют ручной изображения приобретение и длительным количественной оценки, изображений редких событий является сложной задачей. Здесь мы описываем рабочий процесс, который позволяет морфологический анализ десятки тысяч клеток. Иммунные синапсы наведены между первичной клетки человека T в Пан лейкоцита препаратов и золотистый стафилококк энтеротоксинов B SEB-загружен Раджи клетки как БТР. Получение изображения производится с изображений проточной цитометрии, также называется микроскопии в поток, который сочетает в себе черты проточный цитометр и флуоресцентным микроскопом. Предоставляется полный стробирования стратегию для выявления клеток T/APC пары и анализа иммунной синапсы. Как этот рабочий процесс позволяет анализ иммунной синапсов в подготовке неочищенную Пан лейкоцитов и поэтому требует лишь небольшого количества крови (т.е., 1 мл), он может применяться для образцов от пациентов. Важно отметить, что несколько образцов можно подготовлен, измеряется и проанализированы параллельно.
Introduction
Т-клетки являются основными регуляторами адаптивной иммунной системы и активируются через антигенные пептиды, которые представлены в контексте комплексов гистосовместимости (MHC). Полная активация Т-клеток требует двух сигналов, компетенции сигнал через антиген специфические Т-клеточных рецепторов (TCR) / CD3 комплекса и костимуляторных сигнала через аксессуар рецепторов. Обе сигналы генерируются путем непосредственного взаимодействия Т-клеток с антиген представляющих клеток (БТР). Зрелые БТР обеспечивают компетенции сигнал для активации Т-клеток через MHC-пептидных комплексов, и они выражают костимуляторных лигандами (например, CD80 или CD86) заверить прогрессирование Т-клеток активации1. Одной из важных функций костимуляции является перераспределение актина цитоскелета2,3,4. Корковых F-актина относительно статичной в отдыхая Т-клеток. Т-клеточная стимуляция через антиген подшипник БТР приводит к глубокой перестройки Цитоскелет актина. Актина динамика (т.е., быстро актина полимеризации/деполимеризации круги) позволяют Т-клетки для создания сил, которые используются для перевозки белки или органеллы, например. Кроме того Цитоскелет актина имеет важное значение для разработки специальной контактной зоны между Т-клеток и БТР, называется иммунной синапсе. Ввиду важности Цитоскелет актина в иммунной синапса стало необходимо разработать методы количественной оценки изменений в Цитоскелет актина T клетки5,6,,78 , 9.
С помощью актина цитоскелета помощи поверхности рецепторы и сигнализации белки подвергаются сегрегации в супрамолекулярные активации кластерах (SMACs) в пределах иммунной синапса. Стабильность иммунной синапса обеспечивается путем связывания рецепторов к F-актина расслоений, которые повышают эластичность Цитоскелет актина. Было показано, что формирование иммунной синапса иметь решающее значение для поколения адаптивного иммунного ответа. Пагубные последствия формирования дефектных иммунной синапсов в естественных условиях были впервые реализованы в пациентов, страдающих от синдром Вискотта-Олдрича синдром (WAS), заболевание в котором актина полимеризации и сопутствующе обстоятельств, нарушается формирование иммунной синапса10 . Последнее, что пациенты могут страдать от экземы, тяжелой инфекции, аутоиммунные заболевания и меланомы. Несмотря на этот вывод, в настоящее время не известно, отличается ли формирование иммунной синапсов в Т-клетки здоровых лиц и пациентов, страдающих от иммунные дефекты или аутоиммунных заболеваний.
Микроскопии флуоресцирования, включая конфокальный, TIRF и микроскопии суперразрешением, были использованы для раскрыть архитектура иммунной синапса11,12,,1314. Высокое разрешение этих систем и возможность выполнения клеток позволяет коллекции точно, пространственно временной информации о Цитоскелет актина и поверхности или внутриклеточных белков в иммунной синапсе. Многие результаты, однако, основаны на анализе лишь несколько десятков Т-клеток. Кроме того Т-клетки должны быть очищены для этих типов микроскопии флуоресцирования. Однако для многих исследований вопросов, неочищенную клетки, вместо того, чтобы резолюции максимально используется исключительно важное значение. Это актуально, если анализируются Т-клетки от пациентов, поскольку объем донорской крови, ограничен и может быть необходимость обработки множества образцов параллельно.
Мы создали микроскопические методы, которые позволяют проводить анализ Цитоскелет актина в синапсе иммунной системы человека15,16,17. Эти методы основаны на визуализации проточной цитометрии, также называется в поток микроскопии18. Как гибрид между многоспектральных потока цитометрии и флуоресцентной микроскопии, визуализации проточной цитометрии имеет свои сильные стороны в анализе морфологических параметров и локализация протеина в гетерогенных клеточных популяций, как Пан лейкоцитов из периферической крови. Мы ввели методологии, которая позволяет нам дать количественную оценку F-актина в T-клеток/APC конъюгатов человеческих клеток T пробах цельной крови, без необходимости длительной и дорогостоящей очистки шагов17. Техника, представленная здесь включает в себя весь рабочий процесс, от получения образца крови для количественной оценки F-актина в иммунной синапсе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Работы, представленные здесь позволяет количественная оценка иммунной синапсы человека Т-клетки (ex vivo) и БТР. В частности эритроцитов лизированы Пан лейкоциты были использованы в качестве источников Т-клеток, делает шаги очистки Т-клеточная необязательный. Линия B-клеточной лимфомы кл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа финансировалась немецкого научного Совета (DFG) с грантов нет SFB-938-M и SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
