Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux
Summary
Nous décrivons ici un workflow complet pour l’analyse qualitative et quantitative du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines primaires et les cellules présentatrices d’antigène. La méthode est basée sur l’imagerie cytométrie en flux, qui permet l’acquisition et l’évaluation de plusieurs images de milliers de cellules dans un délai relativement court.
Abstract
La synapse immunitaire est le domaine de la communication entre les cellules T et cellules présentatrices d’antigène (CPA). Lymphocytes T polarisent les récepteurs de surface et des protéines vers la synapse immunitaire afin d’assurer une liaison stable et échange de signaux. La microscopie confocale, FRBR ou super-résolution classique ont été utilisées pour étudier la synapse immunitaire. Étant donné que ces méthodes nécessitent l’acquisition d’image manuel et quantification de temps, il est difficile de l’imagerie des événements rares. Nous décrivons ici un workflow qui permet l’analyse morphologique des dizaines de milliers de cellules. Système immunitaires synapses sont induites entre cellules T humaines primaires dans les préparations de pan-leucocytes et cellules de Staphylococcus aureus entérotoxine B SEB-chargé Raji comme TTB. Acquisition d’images s’effectue avec l’imagerie de cytométrie en flux, également appelée microscopie d’influx, qui combine les caractéristiques d’un cytomètre en flux et un microscope à fluorescence. Une stratégie de blocage complete pour identifier les couples de cellules T/APC et analyser les synapses immunitaires est fournie. Car ce flux de travail permet l’analyse d’immunitaire synapses dans des préparations non-purifiés pan-leucocyte et nécessite donc uniquement une petite quantité de sang (p. ex., 1 mL), elle peut être appliquée à des échantillons provenant de patients. Ce qui est important, plusieurs échantillons peuvent être préparés, mesurés et analysés en parallèle.
Introduction
Les lymphocytes T sont les principaux régulateurs du système immunitaire adaptatif et sont activés par l’intermédiaire de peptides antigéniques qui sont présentés dans le cadre des complexes majeurs d’histocompatibilité (MHC). Pleine activation des lymphocytes T nécessite deux signaux, le signal de compétence via le récepteur des cellules T spécifiques de l’antigène (TCR) / CD3 complexe et le signal de costimulation via des récepteurs accessoires. Les deux signaux sont générés par le biais de l’interaction directe des cellules T avec présentatrices d’antigène (CPA) des cellules. TTB mature fournit le signal de compétence pour l’activation des lymphocytes T par l’intermédiaire de complexes MHC-peptide, et qu’ils expriment des ligands costimulation (p. ex., CD80 ou CD86) pour assurer la progression de l’ activation de lymphocytes T1. Une fonction importante de costimulation est le réarrangement de l’actine cytosquelette2,3,4. Le F-actine corticale est relativement statique au repos des cellules T. Stimulation des lymphocytes T par antigène-roulement TTB conduit à une réorganisation profonde du cytosquelette d’actine. Dynamique de l’actine (p. ex., rapide actine polymérisation/dépolymérisation cercles) activer les cellules T créer les forces qui servent au transport des protéines ou des organites, par exemple. De plus, le cytosquelette d’actine est important pour le développement d’une zone spéciale de contact entre lymphocytes T et les APC, appelé la synapse immunitaire. En raison de l’importance du cytosquelette d’actine vers la synapse immunitaire, il est devenu essentiel d’élaborer des méthodes pour quantifier les changements dans le cytosquelette d’actine de cellules de T5,6,7,8 , 9.
Au moyen d’aides du cytosquelette d’actine, récepteurs de surface et les protéines de signalisation sont séparées en grappes activation supramoléculaire (SMACs) au sein de la synapse immunitaire. La stabilité de la synapse immunitaire est assurée par la liaison des récepteurs aux faisceaux d’actine F qui augmentent l’élasticité du cytosquelette d’actine. La formation des synapses immunitaire s’est avérée être critique pour la génération de la réponse immunitaire adaptative. Les effets néfastes d’une formation de synapse immunitaire défectueux in vivo a étaient tout d’abord réalisées chez des patients atteints de maladie de Wiskott Aldrich Syndrome (WAS), une maladie dans laquelle polymérisation de l’actine et, en même temps, la formation des synapses immunitaires sont dérangées10 . A les patients peuvent souffrir de l’eczéma, infections graves à répétition, maladies auto-immunes et mélanomes. Malgré cette conclusion, il n’est pas encore connu si la formation des synapses immunitaire diffère dans les cellules T des individus sains et des patients souffrant d’anomalies immunitaires ou des maladies auto-immunes.
La microscopie de fluorescence, y compris confocale, FRBR et super-résolution microscopie, ont été utilisés pour découvrir l’architecture de la synapse immunitaire11,12,13,14. La haute résolution de ces systèmes et la possibilité d’effectuer l’imagerie de cellules vivantes active la collecte d’informations exactes, spatio-temporelle sur le cytosquelette d’actine et des protéines intracellulaires de surface dans la synapse immunitaire. Beaucoup de résultats, cependant, est basées sur l’analyse de quelques dizaines de cellules T. En outre, les cellules T doivent être purifiées pour ces types de microscopie de fluorescence. Toutefois, pour plusieurs questions de recherche, l’utilisation des cellules non-purifiés plutôt que la résolution plus élevée possible est primordial. C’est utile que si les cellules de T de patients sont analysés, puisque le montant des dons de sang est limité et qu’il pourrait y avoir la nécessité de traiter de nombreux échantillons en parallèle.
Nous avons établi des méthodes microscopiques qui permettent l’analyse du cytosquelette d’actine dans la synapse immunitaire dans le système humain15,16,17. Ces méthodes sont basées sur l’imagerie de cytométrie en flux, également appelée influx microscopie18. Comme un hybride entre la microscopie de cytométrie en flux et fluorescence multispectrale flux, imagerie cytométrie a ses points forts dans l’analyse des paramètres morphologiques et la localisation des protéines dans des populations de cellules hétérogènes, tels que pan-leucocytes de la sang périphérique. Nous avons introduit une méthodologie qui nous permet de quantifier l’actine F en conjugués de T-cellule/APC des cellules T humaines provenant d’échantillons de sang total, sans avoir besoin de purification lente et coûteuse étapes17. La technique présentée ici comprend le flux de travail ensemble, d’obtenir l’échantillon de sang à la quantification de la F-actine dans la synapse immunitaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le flux de travail présentée ici permet la quantification du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines (ex vivo) et APC. Notamment, érythrocytes-lysé pan-leucocytes sont utilisés comme sources de lymphocytes T, faire des étapes de purification de cellules T dispensable. La lignée de cellules de lymphome de B-cellule Raji a servi en tant que substitut TTB. Cela porte des avantages significatifs, puisqu’elle permet des comparaisons entre les donneurs de sang du côté T-cellulaire de la synapse …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travaux ont été financés par le Conseil de la société de recherche allemande (DFG) grâce à des subventions no. SFB-938-M et SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
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