Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo
Summary
Aquí, describimos un completo flujo de trabajo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmunes entre las células de T humanas primarias y células presentadoras de antígeno. El método se basa en imágenes por citometría de flujo, que permite la adquisición y evaluación de varias imágenes de miles de células en un período relativamente corto de tiempo.
Abstract
La sinapsis inmunológica es el área de la comunicación entre las células T y células presentadoras de antígeno (APC). Las células T polarizan receptores de la superficie y proteínas hacia la sinapsis inmune para asegurar a un enlace estable y señal de cambio. Microscopía confocal, TIRF o resolución súper clásico se han utilizado para el estudio de la sinapsis inmune. Puesto que estos métodos requieren la adquisición de la imagen manual y cuantificación desperdiciador de tiempo, la proyección de imagen de eventos raros es difícil. Aquí, describimos un flujo de trabajo que permite el análisis morfológico de decenas de miles de células. Sinapsis inmunológicas son inducidas entre las células primarias humanas T en preparaciones de pan-leucocitos y células de Staphylococcus aureus enterotoxina B SEB cargado Raji como CPA. Adquisición de imágenes se realiza con imágenes de citometría de flujo, también llamado microscopia en flujo, que combina características de un citómetro de flujo y un microscopio de fluorescencia. Se proporciona una completa estrategia bloquea para identificar parejas de la célula de T/APC y analizando la sinapsis inmune. Este flujo de trabajo permite el análisis de inmune sinapsis en preparaciones de pan-leucocito no purificada y por lo tanto requiere solamente un pequeño volumen de sangre (es decir,, 1 mL), puede aplicarse a muestras de pacientes. Importante, varias muestras pueden ser preparadas, medidas y analizadas en paralelo.
Introduction
Las células T son los principales reguladores del sistema inmune adaptativo y se activan a través de péptidos antigénicos que se presentan en el contexto de los complejos de histocompatibilidad (MHC). Completa activación de células T requiere dos señales, la señal de la competencia por el receptor de células T específicas de antígeno (TCR) / CD3 complejo y la señal costimulatory a través receptores accesorios. Ambas señales se generan a través de la interacción directa de las células T con el antígeno que presenta las células (APCs). Madura APC proporcionará la señal de la competencia para la activación de células T a través de complejos MHC-péptido, y expresan ligandos coestimuladoras (e.g., CD80 o CD86) para asegurar la progresión de la activación de células T1. Una función importante de la coestimulación es la reorganización de la actina citoesqueleto2,3,4. La F-actina cortical es relativamente estática en reposo las células de T. Estimulación de células T a través de cojinete de antígeno APC conduce a un profundo reordenamiento del citoesqueleto de actina. Dinámica de la actina (es decir,, rápida actinia polimerización/despolimerización los círculos) permite a las células T crear las fuerzas que se utilizan para el transporte de proteínas u organelos, por ejemplo. Además, el citoesqueleto de actina es importante para el desarrollo de una especial zona de contacto entre las células de T y APC, llamado la sinapsis inmune. Debido a la importancia del citoesqueleto de actina a la sinapsis inmune, se ha convertido en esencial para el desarrollo de métodos para cuantificar los cambios en el citoesqueleto de actina de T las células5,6,7,8 , 9.
Por medio de la ayuda de citoesqueleto de actina, proteínas de señalización y receptores de la superficie están segregadas en grupos de activación supramolecular (SMACs) dentro de la sinapsis inmune. La estabilidad de la sinapsis inmune está garantizada por la Unión de los receptores a paquetes de F-actina que aumentan la elasticidad del citoesqueleto de actina. Formación de sinapsis inmune ha demostrado ser crítica para la generación de la respuesta inmune adaptativa. Los efectos perjudiciales de una formación de la sinapsis inmune defectuoso en vivo primero fueron observados en pacientes que sufren de Wiskott Aldrich síndrome (WAS), una enfermedad en que polimerización de la actina y, simultáneamente, formación de la sinapsis inmune son perturbados10 . FUE de pacientes pueden sufrir de eczema, infecciones recurrentes severas, enfermedades autoinmunes y melanomas. A pesar de este hallazgo, en la actualidad no se sabe si la formación de la sinapsis inmune es diferente en las células de T de individuos sanos y pacientes que sufren de defectos inmunes o enfermedades autoinmunes.
Microscopía de fluorescencia, incluyendo confocal, TIRF y microscopia de la estupendo-resolución, fueron utilizados para descubrir la arquitectura de la sinapsis inmune11,12,13,14. La alta resolución de estos sistemas y la posibilidad de realizar proyección de imagen de células vivas permiten la recopilación de información exacta, spatio-temporal sobre el citoesqueleto de actina y las proteínas de superficie o intracelulares en la sinapsis inmune. Sin embargo, muchos resultados, se basan en el análisis de sólo unas pocas decenas de células T. Además, las células de T deben ser purificadas para estos tipos de microscopía de fluorescencia. Sin embargo, para muchas cuestiones de investigación, el uso de las células no purificadas en lugar de la resolución más alta posible es de suma importancia. Esto es relevante si se analizan las células de T de los pacientes, ya que la cantidad de sangre donada es limitada y podría ser la necesidad de procesar muchas muestras en paralelo.
Establecimos métodos microscópicos que permiten el análisis del citoesqueleto de actina en la sinapsis inmune en el sistema humano15,16,17. Estos métodos se basan en imágenes de citometría de flujo, también llamado de flujo microscopía18. Como un híbrido entre multiespectral flujo cytometry y fluorescencia microscopía, citometría de flujo de imágenes tiene sus fortalezas en el análisis de parámetros morfológicos y la localización de la proteína en las poblaciones celulares heterogéneas, como pan-leucocitos de la sangre periférica. Presentamos una metodología que nos permite cuantificar la F-actina en conjugados del T-cell/APC de células T humanas de muestras de sangre entera, sin la necesidad de purificación lentas y costosas medidas17. La técnica presentada aquí comprende el flujo de trabajo conjunto, de obtener la muestra de sangre para la cuantificación de la F-actina en la sinapsis inmune.
Protocol
Representative Results
Discussion
El flujo de trabajo aquí presentado permite la cuantificación de la sinapsis inmunes entre las células T humanas (ex vivo) y APC. En particular, pan de lisis de eritrocitos-leucocitos fueron utilizados como fuentes de T-cell, haciendo pasos de purificación del T-cell prescindible. La línea de celular del linfoma de células B Raji sirve como sustituto APCs. Esto tiene ventajas significativas, ya que permite las comparaciones entre los donantes de sangre del lado de la sinapsis inmune T-cell. Además, DCs autólogo e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue financiado por el Consejo de investigación alemán (DFG) con subvenciones. SFB-938-M y SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
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