Оценка внутриклеточного расположения реактивнооксигенных видов Solea Senegalensis сперматозоидов
Summary
Этот протокол описывает подробная методология для обнаружения H2O2 локализации в солеа senegalensis сперматозоидов с помощью чувствительных флюрохром DCFH-DA ROS, живой митохондрий пятно на митохондрии и DAPI для ядер Визуализация, соответственно. Протокол призван быть выполнены в течение 2 ч с талой или свежие сперматозоидов.
Abstract
Окислительный стресс является одним из важных факторов в снижении качества спермы. Разработка эффективных протоколов для обнаружения реактивнооксигенных видов (ров) в сперматозоиды имеет большое значение в любых видов, но эти методы являются используется редко и еще меньше в костистых. Криоконсервирование является полезным методом в аквакультуре для различных целей, включая банки генов и гарантированная доступность спермы в течение всего года. Замораживания/оттаивания процедур может вызывать производства рос и повреждение клеток спермы. Учитывая потенциальным ущербом, избыток ROS производства может привести к в сперматозоидов в зависимости от их локализации, здесь подробная методология выявления H2O2 и оценить его внутриклеточной локализации, конфокальная микроскопия предусмотрено. Для этой цели сочетание 3 флуорохромов (2′, диацетата 7′-Dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA), пятно живой митохондрии и 4 ‘, 6-Diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI)), используются для оценки сотрудничества локализации H2O2 с ядрами сперматозоидов или митохондрий в солеа senegalesis образцов спермы.
Introduction
Реактивнооксигенных видов производства был связан с качеством спермы недавно1. Хотя производство рос в митохондриях может считаться нормальный физиологический процесс, окислительный стресс от избыточного производства рос является ясной причины повреждения в сперматозоидов на различных уровнях. В организме человека Оксидативный стресс связан с мужского бесплодия, изменения моторики и возможность пройти капацитации2; в млекопитающих изменения целостности ДНК в замороженной спермы образцы были также связаны с синтез H2O23.
Криоконсервация является общий метод для гена, банковский счет в аквакультуре. Эта технология особенно важна в видов репродуктивных проблем, таких как senegalensis солею. Этот ценных пород на рынке показывает репродуктивного дисфункции у людей, родившихся в заключении из-за отсутствия ухаживания. Этот факт делает спермы криоконсервация необходимо иметь доступность спермы для искусственного оплодотворения. Однако криоконсервация может быть источником оксидативного стресса, которая может быть пагубным для сперматозоидов4 как исследования сообщали положительный эффект антиоксидантных добавок. ROS ингибирование через митохондриальной таргетингом антиоксидант был сообщениям полезно для криоконсервации спермы в желтый сом5.
Таким образом важно знать, особенно после криоконсервирования6,7 , потому что эти молекулы были признаны как недостаток для выживания спермы и фертильность8уровень рос в образцах спермы. Кроме того изучение распределения рос в ячейке может иметь решающее значение для выведения уровень потенциального ущерба. В качестве примера можно предположить низкий уровень рос в митохондриях нормальной и совместим с функцией спермы, но высокий уровень рос внутри ядро может быть показатели повреждения ДНК сперматозоидов. H2O2 является одним из наиболее актуальных рос, что может быть освобожден от митохондрии и проникать ядро, потому что это небольшая и заряд менее молекулы9. Dichlorofluorescein диацетата (DCFH-DA) специально может выявить внутриклеточных перекиси, излучающие зеленый флуоресценции. В этой статье представлен подробный протокол обнаружения H2O2 внутриклеточной локализации в солеа senegalensis спермы с помощью конфокальной микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хорошо известно, что Митохондрии являются ключевыми органеллы для сперматозоидов и функции. Эти органеллы одновременно непосредственно участвуют в производстве рос. Интересно, что для надлежащего спермы функция1необходимы контролируемые уровни ROS. Позитивные отношения ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Эта работа была финансовую поддержку проекта AGL201568330-C2-1-R (МИНЕКО/ФЕДЕР). David G. Valcarce финансировалась хунта-де-Кастилья и Леон (EDU1084/2012) и социальной Europeo Fondo. Авторы признают, что д-р Ана Риаса и Stolt ферме морского с.а., доктор Паулино де Пас, д-р Игнасио Мартинес Монтеро и Хосе Рамон Guiérrez. Мы также благодарим Паулы Фернандес Colado за видеосъемка.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O’Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function–in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
