تقييم موقع داخل الخلايا للأنواع الأكسجين التفاعلية في المني سنغالية سمك
Summary
ويصف هذا البروتوكول منهجية مفصلة للكشف عن ح2س2 التعريب داخل المني سنغالية سمك استخدام حساسة فلوروتشرومي دا دكفه روس، وصمة عار الميتوكوندريا لايف الميتوكوندريا، و DAPI للنوى التصور، على التوالي. تم تصميم البروتوكول التي يتعين القيام بها داخل ح 2 مع المني أما طازجة أو المذابة.
Abstract
الأكسدة أحد العوامل الهامة في انخفاض جودة الحيوانات المنوية. وضع بروتوكولات فعالة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في المني ذو أهمية عالية في أي من الأنواع، ولكن هذه الأساليب نادراً ما تستخدم وحتى أقل في تيليوست. للواسمات هو تقنية مفيدة في تربية الأحياء المائية لأغراض مختلفة، بما في ذلك الجينات المصرفية وضمان توافر الحيوانات المنوية طوال السنة. تجميد/ذوبان إجراءات يمكن أن يسبب إنتاج روس وتلف خلايا الحيوانات المنوية. نظراً للضرر المستقبل أن فائض إنتاج روس يمكن أن يسبب في المني اعتماداً على الترجمة، هنا منهجية مفصلة للكشف عن ح2س2 وتقييم به التعريب داخل الخلايا عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] يتم توفيرها. ولهذا الغرض، تستخدم مزيجاً من فلوروتشروميس 3 (2 ‘، اسيتات 7’-ديتشلوروديهيدروفلوريسسين (دكفه-دا)، وصمة عار يعيش الميتوكوندريا و 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI)) لتقييم التعريب المشارك من ح2س2 مع نويات المني أو الميتوكوندريا في عينات الحيوانات المنوية سينيجاليسيس سمك .
Introduction
ارتبط إنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية مع نوعية الحيوانات المنوية مؤخرا1. على الرغم من أن إنتاج روس في الميتوكوندريا يمكن أن يعتبر عملية فيزيولوجية طبيعية، الأكسدة بفائض في إنتاج روس سببا واضحا للضرر في المني على مختلف المستويات. في البشر، والأكسدة يرتبط بالعقم عند الذكور، تغيير حركية وقدرة على الخضوع تأهيلية2؛ في الثدييات، وقد تغير من سلامة الحمض النووي في عينات الحيوانات المنوية المجمدة ترتبط أيضا بتوليف ح2س23.
للواسمات تقنية شائعة للجينات المصرفية في تربية الأحياء المائية. هذه التكنولوجيا بأهمية خاصة في الأنواع مع مشاكل الإنجاب مثل سمك سنغالية. ويبين هذه الأنواع القيمة في السوق خلل الإنجابية في الأفراد المولودين في الأسر بسبب نقص في فترة الخطوبة. وهذه الحقيقة تجعل تجميد الحيوانات المنوية اللازمة لتوافر الحيوانات المنوية للاخصاب الاصطناعي. ومع ذلك، يمكن أن نعد مصدرا للأكسدة التي يمكن أن تكون ضارة للمني4 كما أفادت الدراسات أثر مفيد لمكملات مضادات الأكسدة. تثبيط روس عن طريق مضادات الأكسدة المتقدرية المستهدفة كان يقال أن مفيد لتجميد الحيوانات المنوية في سمك السلور الأصفر5.
ولذلك، مستويات روس في عينات الحيوانات المنوية من المهم أن نعرف، لا سيما بعد تجميد6،7 لأنه تم الاعتراف بهذه الجزيئات كعيب لبقاء الحيوانات المنوية والخصوبة8. وعلاوة على ذلك، دراسة توزيع روس داخل الخلية يمكن أن تكون حاسمة بالنسبة للاستدلال مستوى الأضرار المحتملة. على سبيل مثال، يمكن الافتراض بمستويات منخفضة من روس في الميتوكوندريا العادي ومتوافقة مع وظيفة الحيوانات المنوية، ولكن مستويات عالية من روس داخل النواة يمكن أن تكون مؤشرات تلف الحمض النووي المني. ح2س2 هو واحد من روس الأكثر أهمية التي يمكن إصدارها من الميتوكوندريا واختراق النواة لأنها جزيء صغير وأقل مقابل9. يمكن أن تكشف ديتشلوروفلوريسسين اسيتات (دكفه-دا) على وجه التحديد بيروكسيد داخل الخلايا التي تنبعث منها الفلورية الخضراء. ويرد في هذه المادة، بروتوكول مفصل لكشف ح2س2 التعريب داخل الخلايا في الحيوانات المنوية سنغالية سمك استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].
Protocol
Representative Results
Discussion
فمن المعروف جيدا أن الميتوكوندريا هي العضيات الرئيسية لعدد الحيوانات المنوية الحركة والوظيفة. وتشارك هذه العضيات في الوقت نفسه مباشرة في إنتاج روس. من المثير للاهتمام، هناك حاجة المستويات التي تسيطر عليها من روس للحيوانات المنوية السليمة الدالة1. أظهرت العلاقات الإيجابية ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أكواجاميتي FA 1205 تكلفة العمل. وأيد هذا العمل ماليا مشروع AGL201568330-C2-1-R (مينيكو/FEDER). ومولت فالكارسي زاي ديفيد دي المجلس العسكري قشتالة وليون (EDU1084/2012) والصندوق الاجتماعي الأوروبي. يعترف المؤلف الدكتورة أنا Riaza وستولت البحر مزرعة S.A. والدكتور باولينو دي باز، والدكتور إغناسيو مارتينيز مونتيرو وخوسيه رامون Guiérrez. ونشكر أيضا باولا فيرنانديز كولادو للفيديو.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O’Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function–in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
