הערכה של המיקום תאיים של מינים חמצן תגובתי ב- Solea Senegalensis Spermatozoa
Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה מפורט לגילוי H2O2 לוקליזציה בתוך Solea senegalensis spermatozoa באמצעות fluorochrome רגיש DCFH-DA ROS, כתם המיטוכונדריה בשידור חי עבור המיטוכונדריה, דאפי עבור גרעינים ויזואליזציה, בהתאמה. הפרוטוקול נועד להתבצע בתוך 2 h עם spermatozoa טריים או המופשרים.
Abstract
סטרס חמצוני הוא אחד הגורמים החשובים בהפחתת באיכות הזרע. פיתוח פרוטוקולי יעיל לגילוי מינים חמצן תגובתי (ROS) ב- spermatozoa היא בעלת חשיבות גבוהה בכל מין, אך שיטות אלה הן נדירות אפילו פחות teleost. הקפאה קריוגנית היא טכניקה שימושית בחקלאות ימית למטרות שונות, לרבות בנקאות ג’ין והבטיחה את הזרע זמינות לאורך כל השנה. הקפאה \ הפשרה הליכים יכול לגרום ROS הייצור, נזק לתאי הזרע. בהתחשב פוטנציאליים נזק זה עודף של ROS הפקה עלול לגרום ב spermatozoa תלוי לוקליזציה שלהם, הנה מתודולוגיה מפורט כדי לזהות2O H2 וכן להעריך שלה לוקליזציה תאיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מסופק. למטרה זו, שילוב של 3 fluorochromes (2 ′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), כתם המיטוכונדריה בשידור חי ו- 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי)) משמשים להערכת ההתאמה שיתוף של H2O2 עם spermatozoa גרעינים או המיטוכונדריה דגימות זרע Solea senegalesis .
Introduction
ההפקה של מינים חמצן תגובתי נקשרה עם איכות זרע לאחרונה1. למרות ROS הייצור בתוך המיטוכונדריה יכול להיחשב תהליך פיזיולוגי נורמלי, סטרס חמצוני על-ידי עודף הייצור ROS הוא סיבה ברורה של פגיעה ב spermatozoa ברמות שונות. בבני אדם, סטרס חמצוני מזוהה עם בעיות פוריות הגבר, שינוי תנועתיות ואת היכולת לעבור capacitation2; ביונקים, שינוי של שלמות הדנ א דגימות זרע קפוא גם קשורה סינתזה של H-2O-2–3.
הקפאה קריוגנית היא טכניקה נפוצה עבור ג’ין בנקאות, חקלאות ימית. טכנולוגיה זו חשוב במיוחד במינים עם בעיות הרבייה כגון Solea senegalensis. מין זה יקר בשוק מראה תפקוד הרבייה אצל אנשים נולדו בשבי עקב מחסור של חיזור. עובדה זו הופכת את הזרע הקפאה קריוגנית חייב להיות זמינות הזרע להפריה מלאכותית. עם זאת, הקפאה קריוגנית יכול להיות מקור של סטרס חמצוני זה יכול להיות מזיקה spermatozoa4 כמו מחקרים דיווחו על השפעה מיטיבה של תוספי נוגדי חמצון. ROS עיכוב באמצעות נוגדי חמצון מיטוכונדריאלי במיקוד היה מועיל הדיווחים על הקפאה קריוגנית זרע שפמנון צהוב5.
לכן, הרמות של ROS דגימות זרע חשובים לדעת, במיוחד לאחר הקפאה קריוגנית6,7 כי מולקולות אלה הוכרו חיסרון זרע הישרדות, פוריות8. יתר על כן, לומד את ההפצה של ROS בתוך התא יכול להיות מכריע להסיק שרמת נזק פוטנציאלי. לדוגמה, רמות נמוכות של ROS בתוך המיטוכונדריה יכול להניח נורמלי ולא תואם עם פונקציית זרע, אך רמות גבוהות של ROS בתוך הגרעין יכול להיות סממנים של נזק לדנ א spermatozoa. H2O2 הוא אחד האבחון הרלוונטיים ביותר יכול להשתחרר מן המיטוכונדריה, לחדור לגרעין כי הוא מולקולה קטנה, תשלום-פחות9. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) באופן ספציפי יכול לחשוף מי חמצן תאיים פולטות קרינה פלואורסצנטית ירוק. במאמר זה, מוצג עבור מזהה H2O2 לוקליזציה תאיים Solea senegalensis הזרע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוטוקול מפורט.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה ידוע כי המיטוכונדריה הם organelles מפתח עבור זרע תנועתיות ותפקוד. Organelles אלה מעורבים במקביל ישירות בייצור ROS. מעניין, רמות מבוקרת של ROS נדרשים עבור זרע תקין פונקציה1. יחסים חיוביים בין פוריות סטרס חמצוני הוכחו יונקים11 אך רמות מוגזמות להשפיע על איכות הזרע12</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים AQUAGAMETE פא 1205 עלות פעולה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקט AGL201568330-C2-1-R (MINECO/פדר). דוד ג Valcarce מומן על ידי דה חונטה ולאון (EDU1084 2012) ו Fondo Europeo חברתית. מחברים מכיר ד ר אנה Riaza, האנרגטי לים חווה דרום אמריקה, ד ר פאולין דה פז, ד ר איגנסיו מרטינס מונטרו, חוסה רמון Guiérrez. אנו מודים גם פאולה פרננדז Colado עבור צילום וידאו.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O’Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function–in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
