Summary

In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

Published: March 16, 2017
doi:

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

Плацента является первым органом развивать в процессе эмбриогенеза и необходим для выживания развивающегося эмбриона. Плацента состоит из различных клеток трофобласта, которые дифференцируются из внеэмбриональной трофэктодерме клеток предимплантационной бластоцисты. Таким образом, наше понимание ранней дифференциации событий плаценты человека ограничена из-за этических и правовых ограничений на изоляции и манипуляции человеческой эмбриогенеза. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) представляют собой надежную модель системы для исследования развития человека , а также могут быть дифференцированы в пробирке в трофобласта клеток , которые экспрессируют маркеры различных типов клеток трофобласта. Здесь мы представляем подробный протокол для дифференциации hPSCs в трофобластических клеток с использованием костного морфогенного белка 4 и ингибиторы / Узловые сигнальных путей активин. Этот протокол генерирует различные трофобласта типы клеток, которые могут быть трансфицированы с киРНКдля исследования с потерей функции фенотип или могут быть заражены патогенами. Кроме того, hPSCs могут быть генетически модифицированы, а затем дифференцировались в трофобласта клеток-предшественников для усиления из-функции анализа. Это в пробирке метод дифференциации для формирования человека трофобласта , начиная с hPSCs преодолевает этические и правовые ограничения работы с ранних человеческих эмбрионов, и эта система может быть использована для различных приложений, включая обнаружение наркотиков и исследования стволовых клеток.

Introduction

Плацента необходим для роста и выживания плода во время беременности и облегчает обмен газов, питательных веществ, отходов производства, а также гормонов между материнской и кровообращение плода. Первый орган формируется во время эмбриогенеза млекопитающих является плацента, которая начинает разработку 6-7 дней после зачатия в организме человека и 3,5-4,5 дней у мышей 1, 2, 3, 4. Трофобластические клетки являются наиболее важными клетками плаценты, и эти клетки представляют собой одну из самых ранних событий дифференцировки родословная зародыша млекопитающих. Они возникают из внешних внеэмбриональной трофэктодерме клеток предимплантационной бластоцисты. Наши знания о ранних стадиях развития плаценты ограничивается этическими и материально-технических ограничений по моделированию раннего развития человеческого потенциала.

Во время эмбрионального имплантации трофобластавторгнуться материнский эпителий и дифференцироваться в специализированные клетки – предшественники 5. Cytotrophoblasts (CTBS) являются Мононуклеированные, недифференцированные клетки-предшественники, которые взрывателем и дифференцируются в syncytiotrophoblasts (SYNs) и extravillous инвазивными трофобласта (EVTs), которые закрепляют плаценту к матке. SYNs являются многоядерные, терминально дифференцированные клетки, которые синтезируют гормоны, необходимые для поддержания беременности. Ранние дифференциации событий , которые генерируют EVTs и SYN , имеют важное значение для формирования плацентарной, так как нарушения в клетках трофобласта приводит к выкидышу, преэклампсии и внутриутробное ограничение роста 1. Которые были разработаны типы линий человеческих клеток трофобласта включают увековечены CTBS и хориокарцинома, которые производят плацентарных гормонов и отображать инвазивные свойства 6. Первичные трофобластические клетки из плацент первого триместра человека могут быть выделены, но клетки быстро дифсовыми и остановить пролиферирующих в пробирке. Важно отметить, что трансформировали и первичные клеточные линии имеют различные профили экспрессии генов, указывая , что онкогенные и увековечил линии трофобласта клеток не могут точно представлять первичные трофобласта 7. Кроме того, эти линии вряд ли будут похожи на плацентарного трофобласта клетки-предшественники стволовых клеток, так как они получены из поздних стадиях первого до третьего триместра.

Существует потребность в надежной в пробирке системы культуры новообразующимися человека трофобласта с целью изучения ранних событий плацентарной формирования и функции. Человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые разделяют свойства с внутренней клеточной массы эмбриона предимплантационной, часто используются для моделирования раннего развития людских ресурсов, в том числе формирование ранней плаценты. Оба человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и ЭСК могут быть дифференцированы в трофобласта в пробирке с использованием Bone Morphogenic белка 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Это превращение плюрипотентных клеток трофобласта клеток с использованием ВМР4 является специфическим для клеток человека и широко используется для изучения развития ранней плаценты человека , поскольку он не требует доступа к ранних эмбрионов человека 9, 16. Недавно было обнаружено, что добавление ингибиторов A83-01 (А) и PD173074 (P), которые блокируют сигнальные пути SMAD2 / 3 и MEK1 / 2, повышает эффективность HPSC дифференциации в трофэктодерме типа клеток-предшественников, в основном SYNs и EVTs, без обширного поколения мезодермы, энтодермы, или клетки эктодермы 9, 17 </suр>. Используя эти средние условия, ЭСК дифференцируются в течение 12 дней имеют сходные профили экспрессии генов как трофэктодерме клеток , выделенных из эмбрионов бластоцисты стадии человека и секретируют различные плацентарные специфические гормоны роста, поддерживая справедливость этого в лабораторных условиях модельной системы 9, 11. Здесь мы представляем подробный протокол для дифференцировки в пробирке hPSCs в предшественниках трофобласта человека с помощью BMP4 / A / P культуральной среды. Эти условия продуцируют обильные количества клеток для широкого спектра применений, в том числе РНК-последовательности, разрушение гена с использованием киРНК, патогеном инфекций и генетической модификации, Липофекция-опосредованной трансфекции.

Protocol

Примечание: Для дифференциации либо ЭСК или hiPSCs в трофобласта клеток-предшественников, hPSCs, выращенные на мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) являются переведены на фидерных свободные условия для двух пассажей до начала дифференцировки с BMP4 / A / P. Этот процесс устраняет MEF загрязнение диффер?…

Representative Results

Обзор In Vitro Дифференциация hPSCs Это в пробирке протокол дифференцировки начинается с недифференцированных ЭСК , выращенных на MEFs, которые перешли на фидерных свободные условия для прохода по одному (Рис . 1А) В ?…

Discussion

Мы представили основные шаги для дифференциации ЭСК в трофобласта клеток-предшественников. Этот протокол недавно был оптимизирован для быстро дифференцировать ЭСК с добавлением активин / сигнализации Узловое ингибиторов, увеличивая дифференциацию клеток трофобласта и избежать обр?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Materials

DMEM/F12 Invitrogen 11330-057
Knock Out Serum Replacement Invitrogen 10828-028 This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA Invitrogen 11140-050
FBS Invitrogen 16000-044
L-Glutamine Invitrogen 10828-028
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-155
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
B-FGF Millipore GF-003
DMEM Invitrogen 11965-118
Dispase Invitrogen 17105-041
Collagenase Type IV Invitrogen 17104-019
Rock inhibitor Y27632 Calbiochem 688000
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem 6001G MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 um syringe filter Millipore SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator Heracell/VWR 89187-192 Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4 R&D Systems 314-BP-01M
A 83-01 R&D Systems 2939/10
PD173074 R&D Systems 3044/10
RNAiMax Invitrogen 13778150
Trizol ThermoFisher 15596026 Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001
Matrigel Corning 356231 This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.

References

  1. Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
  2. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  3. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
  4. Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
  5. Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
  6. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
  7. Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
  8. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  9. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
  10. Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
  11. Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
  12. Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
  13. Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
  14. Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
  15. Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
  16. Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?. Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
  17. Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
  18. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  19. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  20. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  21. Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
  22. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  23. Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
  24. Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
  25. Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
  26. Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
  27. Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
  28. Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
  29. Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).

Play Video

Cite This Article
Wang, J., Anguera, M. C. In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells. J. Vis. Exp. (121), e55268, doi:10.3791/55268 (2017).

View Video