Summary

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Published: March 16, 2017
doi:

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

Die Plazenta ist das erste Organ während der Embryogenese zu entwickeln, und ist für das Überleben der sich entwickelnden Embryo erforderlich. Die Plazenta besteht aus verschiedenen trophoblastic Zellen, die von den extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste unterscheiden. Als solches unser Verständnis der frühen Differenzierungsereignisse der menschlichen Plazenta ist begrenzt, weil der ethischen und rechtlichen Beschränkungen für die Isolation und Manipulation der menschlichen Embryonalentwicklung. Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind eine robuste Modellsystem für die Untersuchung der menschlichen Entwicklung und können auch in vitro in trophoblastische Zellen unterschieden werden , die Marker der verschiedenen Trophoblasten – Zelltypen exprimieren. Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll für hPSCs in Trophoblastzellen mit knochenmorphogenes Protein 4 und Inhibitoren der Activin / Nodal Signalwege zu unterscheiden. Dieses Protokoll erzeugt verschiedene Trophoblastenzelle Typen, die mit siRNAs transfiziert werden könnenzur Untersuchung loss-of-function Phänotypen oder können mit Krankheitserregern infiziert werden. Zusätzlich werden kann hPSCs genetisch modifiziert und dann in Trophoblasten Vorläufern differenziert für gain-of-function Analysen. Diese in vitro Differenzierung Methode menschlichen Trophoblasten zur Erzeugung von hPSCs Ausgangswindet die ethischen und rechtlichen Einschränkungen mit frühen menschlichen Embryonen zu arbeiten, und dieses System kann für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Wirkstoffforschung und Stammzellforschung.

Introduction

Die Plazenta ist für das Wachstum und Überleben des Fötus während der Schwangerschaft erforderlich und erleichtert den Austausch von Gasen, Nährstoffen, Abfallprodukte und Hormone zwischen mütterlichen und fetalen Kreislauf. Das erste Organ während Säugetierembryogenese gebildet ist , der Plazenta, die bei Menschen und 3,5-4,5 Tagen bei Mäusen 1, 2, 3, 4 6-7 Tagen nach der Empfängnis beginnt entwickeln. Trophoblastische Zellen sind die wichtigsten Zellen der Plazenta, und diese Zellen stellen eine der frühesten lineage Differenzierungsereignisse des Säugetierembryo. Sie ergeben sich aus den äußeren extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste. Unser Wissen über die frühen Phasen der Entwicklung der Plazenta wird durch ethische und logistische Einschränkungen begrenzt auf frühe menschliche Entwicklung zu modellieren.

Während der embryonalen Implantation Trophoblastendringen in das mütterliche Epithel und unterscheiden sich in spezialisierte Vorläuferzellen 5. Cytotrophoblasten (CTBs) sind einkernigen, undifferenzierten Vorläufern, die in Synzytiotrophoblasten (SYNs) und extravillösen invasive Trophoblasten (EVT), die Anker, die Plazenta in die Gebärmutter verschmelzen und zu differenzieren. SYNs werden, terminal differenzierte Zellen mehrkernige, die Hormone notwendig für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft zu synthetisieren. Die frühe Differenzierung Ereignisse , die EVTs und SYNs erzeugen , sind von wesentlicher Bedeutung für Plazentabildung, wie Beeinträchtigungen in Trophoblastzellen in einer Fehlgeburt führen, Präeklampsie und intrauterine Wachstumsrestriktion 1. Die Typen der humanen Trophoblasten – Zelllinien , die entwickelt wurden , umfassen CTBs und Chorionkarzinome verewigt, die 6 Plazentahormone und Anzeige invasiven Eigenschaften herzustellen. Primäre trophoblastic Zellen aus menschlichen ersten Trimenon Plazenten isoliert werden können, aber die Zellen schnell difzieren und stoppen in vitro vermehren. Wichtig ist , transformiert und primären Zelllinien unterschiedliche Genexpressionsprofile haben, was darauf hinweist , dass tumorerzeugend und trophoblast immortalisierte Zelllinien nicht genau primäre Trophoblasten 7 darstellen. Darüber hinaus sind diese Linien unwahrscheinlich, dass der Plazenta Trophoblasten Stammzellen Vorläufern ähneln, weil sie von einer späteren Phase ersten bis dritten Trimester abgeleitet werden.

Es besteht ein Bedarf für ein robustes in vitro Kultursystem im Frühstadium menschlichen Trophoblasten , um die frühen Ereignisse der Plazentabildung und Funktion zu untersuchen. Menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen), die Eigenschaften mit der inneren Zellmasse des preimplantation Embryo zu teilen, werden häufig zur Modellierung der frühen menschlichen Entwicklung, einschließlich der Bildung der frühen Plazenta verwendet. Beide menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und HES – Zellen können in Trophoblasten in vitro differenziert werden unter Verwendung von Knochen Morphogenic Protein 4 (BMP – 4) , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Diese Umwandlung von pluripotenten Zellen zu Trophoblastzellen BMP4 Verwendung ist für menschliche Zellen spezifisch und wird weithin verwendet , um die Entwicklung der frühen menschlichen Plazenta zu studieren , weil sie den Zugang zu frühen menschlichen Embryonen nicht erfordert 9, 16. Kürzlich wurde entdeckt, daß die Zugabe der Inhibitoren A83-01 (A) und PD173074 (P), die die SMAD2 / 3 und MEK1 / 2 Signalwege blockieren, erhöht die Effizienz der Differenzierung in HPSC Trophektoderm artigen Vorläufern, hauptsächlich SYNs und EVTs, ohne die umfangreiche Erzeugung von Mesoderm, Endoderm oder Ektodermzellen 9, 17 </sup>. Unter Verwendung dieser Medienbedingungen differenzierte hES für 12 Tage ähnliche Gen – Expression haben Profile als Trophektoderm isolierte Zellen aus menschlichen Blastozysten-Stadium Embryonen und verschiedenen Plazentaspezifische Wachstumshormone absondern, die Unterstützung , die Gültigkeit dieses in vitro Modellsystem 9, 11. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vitro Differenzierung von hPSCs in menschliche Trophoblasten – Vorläufern unter Verwendung von BMP4 / A / P Kulturmedium. Diese Bedingungen erzeugen reichlich Anzahlen von Zellen für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Genzerstörung verwendet siRNAs, Pathogen-Infektionen und genetischen Modifikation unter Verwendung von Lipofektion-vermittelte Transfektion.

Protocol

HINWEIS: Für die Differenzierung von hES entweder oder hiPSCs in trophoblast Vorläufern, hPSCs auf embryonale Fibroblasten Maus gezüchtet (MEF) werden nicht umgestellt Zubringer freien Bedingungen für zwei Passagen vor Differenzierung Initiierung mit BMP-4 / A / P. Dieses Verfahren beseitigt die MEF Kontamination von differenzierten Zellen. Hier stellen wir ein Protokoll für HES-Differenzierung, und das gleiche Protokoll kann zu hiPSCs angewendet werden. 1. Kultur und Gewinnung von hES-Zellen auf Bestrahlte e…

Representative Results

Überblick über die in vitro Differenzierung von hPSCs Diese in vitro Differenzierung Protokoll beginnt mit undifferenzierten hESCs auf MEFs gezüchtet , das umge sind zufuhrfreien Bedingungen für einen Durchgang (1A). Während wir die Differenzierung von hES in diesem Protokoll beschrieben, haben wir dieses Protokoll erfolgreich hiPSCs in trophoblastic Zellen differenzieren. Der Übergang zu …

Discussion

Wir präsentierten die grundlegenden Schritte zur hESCs in trophoblast Vorläufern unterscheiden. Dieses Protokoll wurde kürzlich optimiert, um schnell hESCs mit der Zugabe von Activin / Nodal Signalisierungs Inhibitoren unterscheiden, die Differenzierung zu trophoblastische Zellen zu erhöhen und die Erzeugung von Mesoderm Progenitoren vermeiden, die mit BMP4 Behandlung werden in der Regel allein beobachtet. Das BMP-4-Modell-System ermöglicht die Prüfung der frühesten Stadien der menschlichen Trophoblasten Linie Sp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Materials

DMEM/F12 Invitrogen 11330-057
Knock Out Serum Replacement Invitrogen 10828-028 This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA Invitrogen 11140-050
FBS Invitrogen 16000-044
L-Glutamine Invitrogen 10828-028
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-155
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
B-FGF Millipore GF-003
DMEM Invitrogen 11965-118
Dispase Invitrogen 17105-041
Collagenase Type IV Invitrogen 17104-019
Rock inhibitor Y27632 Calbiochem 688000
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem 6001G MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 um syringe filter Millipore SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator Heracell/VWR 89187-192 Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4 R&D Systems 314-BP-01M
A 83-01 R&D Systems 2939/10
PD173074 R&D Systems 3044/10
RNAiMax Invitrogen 13778150
Trizol ThermoFisher 15596026 Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001
Matrigel Corning 356231 This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.

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Cite This Article
Wang, J., Anguera, M. C. In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells. J. Vis. Exp. (121), e55268, doi:10.3791/55268 (2017).

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